| Lizenz: Creative Commons Namensnennung 4.0 International (5MB) |
- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-416455
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.41645
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 27 Februar 2020 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Prof. Dr. Ralf Wagner |
| Tag der Prüfung: | 18 November 2019 |
| Institutionen: | Medizin > Lehrstuhl für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene |
| Stichwörter / Keywords: | Codonusage, HIV, Genexpression, Codonwahl, Codonbias, |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 500 Naturwissenschaften 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 41645 |
Zusammenfassung (Englisch)
The degeneracy of the genetic code with its 61 codons encoding for only 20 amino acids is the basis for a phenomenon known as codon usage bias. That means that different organisms show differences in the frequency of occurrence of synonymous codons. Despite the necessity of HIV to use the host’s translational machinery for viral gene expression, the virus exhibits an adenine-rich nucleotide ...
Zusammenfassung (Englisch)
The degeneracy of the genetic code with its 61 codons encoding for only 20 amino acids is the basis for a phenomenon known as codon usage bias. That means that different organisms show differences in the frequency of occurrence of synonymous codons. Despite the necessity of HIV to use the host’s translational machinery for viral gene expression, the virus exhibits an adenine-rich nucleotide composition which differs clearly from the GC-rich coding regions of humans. Changing the nucleotide composition by choosing synonymous codons at certain positions might therefore impact viral replication by affecting viral gene expression. Previous studies of our group showed that adapting the gag gene to human codon usage (huGag) led not only to a significantly increased protein production but also caused independency of Rev, an accessory protein of HIV that exports intron-containing viral mRNAs. The aim of this work was to gain insight into the effects of codon adaptation, especially regarding length and position, and the associated impact on gag expression. For this, subgenomic gag reporter constructs were generated that systematically varied the humanized part of the gene. Those constructs were then transfected into HEK293T cells. Gag expression was investigated on protein level by p24 ELISA as well as on RNA level by qPCR. Furthermore, transcription efficiency as well as RNA stability were analyzed using nuclear run-on and actinomycin D assays. It was observed that increasing the length of the humanized sequence starting from the 5’ end directly correlated with p24 and gag mRNA levels. Contrary to that, such a correlation was lacking for constructs humanized progressively in 3’ to 5’ direction. It became apparent that humanization of the 5’ end of gag is necessary for enhanced protein production and Rev-independent expression. In addition, it was found that a short sequence, surrounding the nucleotides 61-75 of gag in the 5’-part of the gene contains a specific inhibitory motif which affects transcription rate as well as RNA stability. Moreover, the expression pattern of the different variants was analyzed under the control of a heterologous CMV promoter as well as an LTR promoter of HIV-1. For both systems, comparable expression patterns were observed. By PCR analysis of reverse transcribed RNA from transfected cells, as well as northern blot analysis, the generation of cryptic splicing variants was excluded. Further, a second reporter gene was used in order to investigate whether the function of the identified inhibitory motif could be transferred. For this, a quasi-lentiviral system was used to express egfp after its adaptation to human and HI-viral codon usage. It became apparent that the inhibitory effect of the identified motif was only transferable when it was embedded in a larger part of wild-type gag. The influence of the inhibitory motif on HIV gag expression as well as the missing inhibitory effect on egfp could be based on characteristics of the mRNA secondary structures. For gag, but not for egfp variants, presence of the motif had a clearly destabilizing effect in mRNA folding predictions, which might influence protein binding of the RNA degradation machinery. In future experiments an examination of this hypothesis would be eligible and helpful to gain further insight in the connection between altered codon usage and gene expression.
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Die Codierung von 20 Aminosäuren durch 61 Codons stellt die Grundlage für ein Phänomen dar, welches als codon usage bias bekannt ist. Das heißt, es gibt Unterschiede in der Häufigkeit verwendeter Codons zwischen unterschiedlichen Organismen. Trotz der Notwendigkeit von HIV die zelluläre Translationsmaschinerie zu nutzen, weist das Virus eine Adenin-reiche Nukleotidkomposition auf, welche sich ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Die Codierung von 20 Aminosäuren durch 61 Codons stellt die Grundlage für ein Phänomen dar, welches als codon usage bias bekannt ist. Das heißt, es gibt Unterschiede in der Häufigkeit verwendeter Codons zwischen unterschiedlichen Organismen. Trotz der Notwendigkeit von HIV die zelluläre Translationsmaschinerie zu nutzen, weist das Virus eine Adenin-reiche Nukleotidkomposition auf, welche sich klar von den GC reichen, codierenden Regionen von Menschen unterscheidet. Veränderungen der Nukleotidkomposition durch die Wahl synonymer Codons an definierten Positionen könnten daher die virale Replikation durch Einflussnahme auf die Genexpression beeinflussen. In früheren Arbeiten der Arbeitsgruppe konnte bereits gezeigt werden, dass die Adaption des gag Gens an den humanen Codongebrauch (huGag) nicht nur zu einer signifikant erhöhten Proteinproduktion führte, sondern auch eine Rev-Unabhängigkeit bewirkte, einem akzessorischen viralen Protein, welches den Export intronhaltiger viraler mRNAs bewerkstelligt.
Ziel dieser Arbeit war es die Effekte der Codonwahl auf die Genexpression zu untersuchen, speziell im Hinblick auf die Paramter Länge und Position der adaptierten Codons. Hierfür wurden subgenomische gag Reporterkonstrukte generiert die bezüglich des humanisierten Bereichs systematisch variierten. Diese Varianten wurden anschließend in HEK293T Zellen transfiziert. Die Gag Expression wurde sowohl auf RNA Ebene mittels qPCR als auch auf Protein Ebene mittels p24-ELISA quantifiziert. Weiterhin wurde sowohl die RNA Stabilität mittels Actinomycin-D Experimenten, als auch die Transkriptionseffizienz mittels nuclear run-on Experimenten analysiert. Es zeigte sich, dass eine Erweiterung des humanisierten Bereichs ausgehend vom 5’ Ende des gag Gens direkt mit der p24 und Gag mRNA Expression korrelierte. Im Gegensatz dazu war ein vergleichbarer Zusammenhang nicht für Varianten nachweisbar, bei denen die Humanisierung stufenweise in 3‘-5‘ Richtung erfolgte. Es wurde ersichtlich, dass die Humanisierung des 5‘ Bereichs von gag eine Voraussetzung für eine gesteigerte und Rev-unabhängige Genexpression darstellt. Darüber hinaus wurde ein kurzes inhibitorisches Sequenzmotiv im Bereich der Nukleotide 61-75 von gag lokalisiert, welches sowohl die Transkriptionsrate als auch die RNA Stabilität beeinflusst. Ein Vergleich der Expression der Varianten unter Kontrolle eines heterologen CMV Promotors bzw. eines LTR Promotors von HIV-1 zeigte keine signifikanten Expressionsunterschiede. Darüber hinaus, konnte die Generierung kryptischer Splicing-Varianten mittels qPCR und Northernblot-Analyse ausgeschlossen werden. Zusätzlich wurde ein zweites Reportergen verwendet um zu überprüfen, ob sich die Funktion des identifizierten inhibitorischen Motivs transferieren lässt. Hierfür wurde ein quasi-lentivirales System genutzt um egfp nach der Adaption an den humanen Codongebrauch zu exprimieren. Es zeigte sich, dass der inhibitorische Effekt nur übertragen werden kann, wenn das Sequenzmotiv in einen größeren Teil des wildtyp gag Gens eingebettet ist. Die beobachteten Effekte könnten weitestgehend auf charakteristische Änderungen der mRNA Sekundärstruktur zurückzuführen sein. So zeigte sich für die gag, jedoch nicht für egfp Varianten ein destabilisierender Effekt des inhibitorischen Motivs in Vorhersagen der RNA Faltung. Diese könnte die Protein Bindung der RNA Degradationsmaschinerie beeinflussen. In zukünftigen Experimenten könnte eine tiefergehende Analyse dieser Hypothese wertvolle Einblicke über den Einfluss der Codonwahl auf die Genexpression liefern.
Metadaten zuletzt geändert: 25 Nov 2020 16:47
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