| Lizenz: Creative Commons Namensnennung 4.0 International (4MB) |
- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-413447
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.41344
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 1 Juli 2020 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Prof. Dr. Inga D. Neumann |
| Tag der Prüfung: | 13 Dezember 2019 |
| Institutionen: | Biologie und Vorklinische Medizin > Institut für Zoologie > Tierphysiologie/Neurobiologie (Prof. Dr. Inga Neumann) |
| Stichwörter / Keywords: | Oxytocin, anxiety, corticotropin releasing factor receptor 2, alternative splicing |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 590 Tiere (Zoologie) |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 41344 |
Zusammenfassung (Englisch)
The neuropeptide oxytocin (OT) plays a prominent role in the regulation of a variety of behavioral processes like maternal behavior, anxiety-, and stress-related behaviors as well as social behaviors. Due to the well-known link to psychiatric disorders associated with anxiety, fear, and socio-emotional dysfunctions, OT is considered a viable treatment option for these diseases (Neumann and ...
Zusammenfassung (Englisch)
The neuropeptide oxytocin (OT) plays a prominent role in the regulation of a variety of behavioral processes like maternal behavior, anxiety-, and stress-related behaviors as well as social behaviors. Due to the well-known link to psychiatric disorders associated with anxiety, fear, and socio-emotional dysfunctions, OT is considered a viable treatment option for these diseases (Neumann and Slattery, 2016). Despite the profound knowledge from various rodent (Blume et al., 2008; Jurek et al., 2015; Jurek et al., 2012) and human studies (MacDonald and Feifel, 2014; Meyer-Lindenberg et al., 2011) on the beneficial effects of acute or short-term OT applications, the impact of extended treatment duration on the behavioral outcomes and OT receptor (OTR) signaling cascades remains rather sparsely investigated (Neumann and Slattery, 2016).
Thus, the thesis presented here aimed to unravel the molecular mechanisms and the behavioral effects that are caused by chronic OT. Intracerebroventricular infusions of a high dose of OT (10 ng/h) via osmotic minipumps for 14 days led to increased anxiety-related behavior in male rats, whereas a lower dose (1 ng/h) had no effect. Additionally, a strong sexual dimorphism was observable. Female rats showed increased anxiety levels induced by the low dose of chronic OT and a trend in the higher dose, suggesting a higher sensitivity of females to OT.
On a molecular level, I identified a sex-specific signaling cascade mediating the observed chronic OT-induced anxiogenic phenotype. Chronic OT stimulated mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling via phosphorylation of the kinases mitogen-activated protein kinase kinase (MEK1/2) and the extracellular signal-regulated kinase 1/2 (ERK1/2), and recruited further downstream the transcription factor myocyte enhancer factor 2 (MEF2). In more detail, dephosphorylation of the isoform MEF2A at the amino acid residue serine 408, a transcriptional inhibitory phosphorylation site, appeared to be the main player in chronic OT-induced anxiogenesis in male rats. Subsequent analysis of several stress-, anxiety-, and neuroplasticity-related MEF2-target genes revealed an involvement of the corticotropin releasing factor receptor 2 α (CRFR2α). In comparison to the CRFR1, CRFR2 has overall anxiolytic properties, brain region- and stress-dependent anxiogenic effects have been previously observed, though (Dedic et al., 2018; Deussing and Chen, 2018)and references therein). I confirmed the anxiolytic properties of CRFR2 activity in the paraventricular nucleus (PVN) of the hypothalamus of male rats in an agonist/antagonist experiment under mild stress conditions. The close link between stress and the OT system (Winter and Jurek, 2019)and references therein) was confirmed in my study, as the anxiogenic effect of chronic OT depended on a mild stressor 24 h prior to behavioral testing.
The Crfr2 mRNA undergoes several alternative splicing events, resulting in two different isoforms in rodents (CRFR2α, CRFR2β) and an additional one in humans (CRFR2γ). I found changes in the expression of the brain-specific CRFR2α in male rats after chronic OT treatment. Not only was the expression of CRFR2α altered, but also an additional alternative splicing event of Crfr2α mRNA towards a shorter soluble isoform, sCRFR2α (Chen et al., 2005; Evans and Seasholtz, 2009) could be linked to chronic OT infusions. I detected a shift from membrane-associated mCRFR2α expression towards cytoplasmic distribution and extracellular release of the soluble sCRFR2α caused by chronic OT. Manipulation of either mCRFR2α or sCRFR2α expression conferred anxiogenic properties to the splice variant sCRFR2α.
Knockdown studies in vitro linked both the expression and alternative splicing of the CRFR2α to MEF2A activity. However, in females no activation of MEF2 and downstream of CRFR2α, and alternative splicing could be detected. Signaling via alternative MAPK targets is conceivable and deserves further investigation.
Furthermore, with OT-induced changes in neuronal morphology shown in previous studies (Lestanova et al., 2016a; Meyer et al., 2018) as well as in this thesis, OT caused significant neurite retraction, and the behavioral consequences due to chronic administration of OT, treatment duration and dosage have to be considered carefully in a clinical context.
The establishment of a new OTR knockout cell line by means of CRISPR-Cas9 enables further comparative signaling as well as morphological analysis. Here, the impairment of MAPK signaling and neurite retraction could be linked to the loss of the OTR.
Overall, the presented data elucidate the differential behavioral as well as molecular consequences of acute versus chronic OT applications in rodents. It provides a general strategy for the analysis of neuropeptide effects both in vitro and in vivo and challenges the beneficial effects of OT and its status as a potential treatment option for psychiatric disorders. Treatment dosage, duration as well as the gender of the patients have to be taken into account. However, the newly discovered connection between anxiety and the soluble splice variant sCRFR2α might lead to new anamnesis and treatment approaches for anxiety disorders.
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Das Neuropeptid Oxytocin (OT) spielt eine zentrale Rolle bei der Regulierung verschiedener Verhaltensabläufe. Sowohl mütterliches Verhalten, Reaktionen in Stresssituation als auch Sozialverhalten werden maßgeblich von OT beeinflusst (Jurek and Neumann, 2018). Daher rückte OT ebenfalls in den Fokus der Wissenschaft als ein mögliches Medikament für die Behandlung von psychischen Erkrankungen, wie ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Das Neuropeptid Oxytocin (OT) spielt eine zentrale Rolle bei der Regulierung verschiedener Verhaltensabläufe. Sowohl mütterliches Verhalten, Reaktionen in Stresssituation als auch Sozialverhalten werden maßgeblich von OT beeinflusst (Jurek and Neumann, 2018). Daher rückte OT ebenfalls in den Fokus der Wissenschaft als ein mögliches Medikament für die Behandlung von psychischen Erkrankungen, wie Angststörungen (Neumann and Slattery, 2016). Der zugrundeliegende Wirkmechanismus von OT ist bereits gut erforscht. Zahlreiche Studien in Mäusen, Ratten (Blume et al., 2008; Jurek et al., 2015; Jurek et al., 2012), sowie in Menschen (MacDonald and Feifel, 2014; Meyer-Lindenberg et al., 2011) konnten bereits positive Verhaltenseffekte von OT zeigen. Die Aktivierung verschiedener Signalkaskaden, allen voran der mitogen-activated protein kinase (MAPK) Signalweg, konnten mit OT bereits in Zusammenhang gebracht werden. Allerdings haben sich bis jetzt nur wenige Studien mit den Langzeiteffekten einer OT-Behandlung auseinandergesetzt. Das ist insbesondere von großer Bedeutung im Hinblick auf die potentielle Behandlung von autistischen Kindern mit OT (Neumann and Slattery, 2016).
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Effekte einer chronischen OT-Behandlung sowohl auf molekularer Ebene als auch im Hinblick auf Verhaltensänderungen zu untersuchen. Männlichen und weiblichen Ratten wurden osmotische Minipumpen implantiert, welche über einen Zeitraum von 14 Tagen kontinuierlich zwei verschiedene Dosen (1 ng pro Stunde und 10 ng pro Stunde) OT in den Lateralventrikel abgaben. In beiden Geschlechtern konnte ich anschließend erhöhtes Angstverhalten in verschiedenen Verhaltenstests feststellen. Weibchen schienen sensitiver bereits auf die niedrigere Dosis (1 ng/h) zu reagieren, wohingegen in Männchen nur eine hohe Dosis OT (10ng pro Stunde) zu vermehrter Angst führte. Die nachfolgende molekulare Analyse der aktivierten Signalkaskaden zeigte auch hier geschlechtsspezifische Unterschiede. Die starke angstfördernde Wirkung, die die hohe Dosis in Männchen hervorgerufen hat, basiert auf einer Aktivierung des MAPK Signalwegs durch die Phosphorylierung der Kinasen MEK1/2 und nachfolgend ERK1/2. Dies wurde auch bereits in Zusammenhang mit akuter OT Gabe gezeigt (Blume et al., 2008; Jurek et al., 2015; Jurek et al., 2012). Weiterführende molekularbiologische Untersuchungen zeigten dann allerdings gravierende Unterschiede zwischen einer akuten und einer chronischen Gabe von OT auf. Chronische OT-Behandlung führte zur Aktivierung des Transkriptionsfaktors myocyte enhancer factor 2 (MEF2). Dieser verfügt über verschiedene Isoformen (MEF2A, B, C und D) und kann an vielfältigen Aminosäuren phosphoryliert werden, was unterschiedliche Effekte auf die Transkription der Zielgene hat. Je nach Phosphorylierungsstelle kann die Transkription entweder aktiviert oder inhibiert werden. Insbesondere ein reduzierter Phosphorylierungsgrad von MEF2A an der Aminosäure Serin 408 scheint an der Verhaltensänderung durch hochdosiertes chronisches OT beteiligt zu sein. Phosphorylierung an dieser Stelle führt in der Regel zur Inhibierung nachfolgender Transkription. In diesem Fall wird durch verminderte Phosphorylierung die Expression und das alternative Spleißen der corticotropin releasing factor receptor 2 α (Crfr2α) mRNA verstärkt. Je nachdem in welcher Gehirnregion dieser Rezeptor aktiviert wird und abhängig von der Stresssituation, hat er angstlösende oder angstfördernde Eigenschaften. Durch gezielte Aktivierung und Blockierung konnte ich eine angstlösende Funktion dieses Rezeptors im Paraventrikulären Nukleus (PVN) des Hypothalamus von männlichen Ratten feststellen. Dabei waren die Ratten leichten, kurzfristigen Stressbedingungen ausgesetzt.
Wie bereits erwähnt, ist auch das alternative Spleißen dieses Rezeptors von chronischem OT betroffen. Dies hat zur Folge, dass mehr von einer löslichen, kleineren Spleißvariante (sCRFR2α) produziert wird, welche nicht nur im PVN, sondern auch in der zerebrospinalen Flüssigkeit nachgewiesen werden konnte. Bis jetzt war die Funktion dieser Spleißvariante weitgehend unbekannt. Durch gezielte Manipulation auf mRNA Ebene konnte ich jedoch ihre angstfördernden Eigenschaften nachweisen. Außerdem konnte ich durch weiterführende in vitro Studien die vermehrte Expression von sCRFR2α und die veränderte Aktivität von MEF2A direkt in Zusammenhang stellen und einen Einfluss von OT auf die Morphologie von Neuronen feststellen.
Die Signalkaskade von OT über MAPK Aktivierung, reduzierte MEF2A Aktivität und anschließendes alternatives Spleißen konnte jedoch nur in männlichen Ratten nachgewiesen werden, was eine geschlechtsspezifische Regulierung nahelegt. Im Hinblick auf OT als mögliches Medikament für psychische Erkrankungen ist es unbedingt nötig, den genauen Mechanismus auch in Weibchen zu untersuchen, um optimierte Behandlungspläne für weibliche und männliche Patienten zu erstellen.
Um weitere molekularbiologische Untersuchungen der Signalkaskaden zu erleichtern, wurde eine OTR Knockout Zelllinie generiert. Erste Analysen zeigten bereits verminderte Aktivität des MAPK Signalweges, als auch Verlust der charakteristischen Änderungen der Morphologie, die Stimulationen mit OT normalerweise auslösen.
Zusammengefasst trägt die hier vorgelegte Arbeit zu einem besseren Verständnis sowohl der molekularen Signalwege als auch der Veränderungen auf Verhaltensebene bei, welche von chronischer OT-Behandlung hervorgerufen werden. Es zeigten sich gravierende Unterschiede im Vergleich zu akuter OT Behandlung, die für die weitere Entwicklung von OT als Medikament für psychische Erkrankungen berücksichtigt werden müssen. Die hier aufgezeigte Herangehensweise zur Analyse von chronischen Effekten kann verallgemeinert auch als Basis für Studien an anderen Neuropeptiden herangezogen werden.
Metadaten zuletzt geändert: 25 Nov 2020 17:06
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