| Lizenz: Creative Commons Namensnennung-KeineBearbeitung 4.0 International (51MB) |
- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-365945
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.36594
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 2 November 2018 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Prof. Dr. Joachim Wegener |
| Tag der Prüfung: | 25 Januar 2018 |
| Institutionen: | Chemie und Pharmazie > Institut für Analytische Chemie, Chemo- und Biosensorik Chemie und Pharmazie > Institut für Analytische Chemie, Chemo- und Biosensorik > Bioanalytik und Biosensorik (Prof. Joachim Wegener) |
| Stichwörter / Keywords: | Sauerstoffsensorik, Imaging, Impedanzanalyse, Zellkultur, Wundheilungsassay |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 540 Chemie |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 36594 |
Zusammenfassung (Englisch)
Eukaryotic cells need oxygen to sustainably produce the metabolite ATP as their main source of energy. Next to glucose, oxygen is one of the key metabolites which can give us insight into cellular processes and conveys important information of parameters like cellular viability, metabolic activity and physiology. Thus, knowledge about cellular oxygen consumption is an essential parameter not only ...
Zusammenfassung (Englisch)
Eukaryotic cells need oxygen to sustainably produce the metabolite ATP as their main source of energy. Next to glucose, oxygen is one of the key metabolites which can give us insight into cellular processes and conveys important information of parameters like cellular viability, metabolic activity and physiology. Thus, knowledge about cellular oxygen consumption is an essential parameter not only when studying pathophysiological conditions, such as metabolic disease, cancer or stroke, but also in drug and cytotoxicity screening. Methods to assess oxygenation levels and oxygen consumption of cells, spheroids and tissue range from electrochemical detection to the use of magnetic resonance and radioisotope techniques. However, in recent years the detection of oxygen by luminescence quenching of indicator dyes has emerged as a useful technique to study oxygenation of eukaryotic cells. Thus, one of the main projects in this work was to use planar oxygen sensitive culture substrates based on luminescence quenching as a novel means to estimate and image the oxygen consumption in 2D and 3D cell culture models. The substrates allowed the cultivation of adherent mammalian cells directly on the surface which provides the possibility to measure oxygen content directly beneath the cell monolayer. The combination of planar oxygen sensor foils with a suitable camera system enabled non-invasive, online monitoring of the spatial and the temporal oxygen distribution beneath the cell layer.
The first project addressed the measurement of the oxygen consumption rate of adherent mammalian monolayer cells. Therefore, an imaging system based on microscopy optics (VisiSens TD mic) was developed in cooperation with PreSens GmbH, Regensburg. The system fits inside a standard cell incubator (48 l) and allows imaging the spatial and temporal distribution of oxygen with high resolution. Planar, polymer based oxygen sensitive foils (SF-RPSu4, PreSens GmbH) for a ratiometric fluorescence readout were used as growth substrates which allowed monitoring the oxygen content directly underneath the adherent cells. The sensor foils exhibited high photostability and biocompatibility which allowed their usage for long term cell experiments. The novel imaging system was used for first proof-of-concept studies to assess oxygen consumption rates in dependence on culture vessel volume and cell seeding density yielding highly reproducible results. Additionally, the novel ratiometric imaging system allowed the successful monitoring of the influence of medium composition, extracellular pH, drugs and toxins on respiratory activity of adherent cells. The high spatial resolution of the camera was used for long term imaging of oxygen gradients caused by a metabolically active spot of monolayer cells.
Multiparametric monitoring of cells is a useful approach to obtain multiple information in one measurement. Thus, the second project focused on combining the optical oxygen sensing with impedimetric monitoring to obtain information about cell metabolic activity and cell morphology changes. Therefore, gold film electrodes were sputtered on planar, ratiometric oxygen sensor foils using a laser cut mask. A PDMS chamber was glued on top of the foil that served as cultivation chamber for the adherent mammalian cells. The dual ECIS-O2 sensor allowed simultaneous, non-invasive online recording of impedance and pO2 using a standard impedance analyzer and a commercial oxygen imaging system (VisiSens A1). Impedance changes were monitored for the cell population residing on the linear gold film electrodes, while oxygen levels were measured for those cells on the electrode-free sensor film. The dual sensor was characterized regarding its biocompatibility, signal stability and most sensitive impedimetric monitoring frequency. First studies conducted with the dual chip allowed simultaneous monitoring of the oxygen consumption and the impedance during cell adhesion. Moreover, the ECIS-O2 chip was used to investigate the influence of uncouplers and blockers of oxidative phosphorylation with impedance measurements providing information about changes in cell morphology and electrode coverage, while the ratiometric fluorescence readout reports on the cellular oxygen consumption rate.
3D tissue models such as multicellular tumor spheroids are considered useful in vitro tools in biomedical and clinical research. Due to their 3D structure, they close the gap between simple 2D monolayer cell culture and native tissue structures. Multicellular spheroids mimic physiological conditions found in tissue more closely compared to standard 2D cell culture, while handling and cultivation is easier compared to tissue. This makes multicellular tumor spheroids an attractive means in biomedical research and drug screening. Long-term studies on oxygenation in live spheroids are scarce because most assays are either endpoint-based or invasive such as microneedle or particle based approaches. Thus, the third project applied the novel imaging system VisiSens TD mic for quantitative monitoring of oxygenation levels within live MCF-7 tumor spheroids under standard growth conditions. Originally spherical spheroids were allowed to attach and spread on planar, biocompatible oxygen sensor foils forming half-spherical cell aggregates and oxygen content beneath the spheroid was monitored online with high spatio-temporal resolution. The imaging set-up allowed recording the detailed 2D distribution of oxygen gradients caused by metabolically active spheroids with higher resolution compared to commercially available imaging systems. Further studies were conducted investigating the effect of drugs blocking or uncoupling oxidative phosphorylation on oxygen gradients established in live and metabolically active MCF-7 spheroids.
Wound healing assays are often used to study collective cell migration in vitro. The general concept of such assays is to introduce an artificial wound into a confluent layer of adherent cells and to study the migration of non-wounded cells from the periphery into the wound. The aim of the fourth project was the development of a novel wound healing assay based on oxygen sensitive culture substrates. The assay uses planar, polymer-based culture substrates with an embedded oxygen sensor dye as culture substrates for adherent cells. The functional layer was deposited on coverslips by spin-coating providing a transparent composite substrate that is addressable by light microscopy. Upon illumination with a suitable wavelength the dye molecules were excited. The 1O2 produced by luminescence quenching was used to selectively kill cells residing on areas of the functional coating that were exposed to the illumination light generating wounds with a highly reproducible geometry. The oxygen sensitive substrates designed for wound healing were analyzed regarding their biocompatibility and the influence of parameters such as light source, microscope filter settings and medium composition on wounding efficacy was tested. The novel wound healing assay was used to probe collective cell migration under various experimental conditions and it was compared to other wound healing assays such as scratch, barrier and ECIS® assay regarding parameters such as cost, throughput, reproducibility or wound morphology. Similar to the ECIS ® assay, wounds produced by the novel optical wound healing assay mimic the physiological conditions more closely, as dead cells remain as debris in the wound. Additional studies were performed investigating wound healing behavior of epithelial cells exposed to different extracellular pH values which resulted in reduced wound healing rates at low pH. Furthermore, it was shown that serum starvation and cytochalasin C reduced wound closure rate as well.
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Eukaryotische Zellen benötigen Sauerstoff, um nachhaltig Energie in Form von ATP zu erzeugen. Daher ist Sauerstoff neben Glukose der Schlüssel-Analyt, mit dessen Hilfe sich Aussagen über wichtige zelluläre Parameter, wie Vitalität, metabolische Aktivität oder Physiologie treffen lässt. Ein veränderter zellulärer Sauerstoffverbrauch ist unter anderem ein wichtiger Indikator um pathophysiologische ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Eukaryotische Zellen benötigen Sauerstoff, um nachhaltig Energie in Form von ATP zu erzeugen. Daher ist Sauerstoff neben Glukose der Schlüssel-Analyt, mit dessen Hilfe sich Aussagen über wichtige zelluläre Parameter, wie Vitalität, metabolische Aktivität oder Physiologie treffen lässt. Ein veränderter zellulärer Sauerstoffverbrauch ist unter anderem ein wichtiger Indikator um pathophysiologische Zustände wie Krebs, Stoffwechselerkrankungen oder Schlaganfall zu identifizieren. Zudem können unterschiedliche Respirationsraten Aufschluss über die anaerobe Stoffwechselaktivität geben, was insbesondere bei Arzneimitteltests und Zytotoxizitätsscreenings von Interesse ist. Neben der elektrochemischen Bestimmung mittels Clark Elektrode, kann der Sauerstoffverbrauch von Zellen, Gewebemodellen und Geweben auch durch Magnetresonanz- oder Radioisotopentechniken ermittelt werden. Mittlerweile gewinnt die Detektion des zellulären Sauerstoffverbrauchs basierend auf der Lumineszenzlöschung von Indikatorfarbstoffen immer mehr an Bedeutung. Daher befasste sich diese Arbeit mit der Verwendung von planaren Substraten, die mit einer sauerstoffsensitiven Schicht überzogen sind und die eine Bestimmung des Sauerstoffgehalts über die Lumineszenzlöschung erlauben. Adhärente Säugetierzellen wurden direkt auf der Sensoroberfläche kultiviert, um eine Bestimmung des Sauerstoffgehalts direkt unter der Zellschicht zu ermöglichen. Durch die Kombination der planaren Sauerstoffsensorfolien mit einem geeigneten Kamerasystem wurde die räumliche und zeitliche Änderung des Sauerstoffgehalts unterhalb der Zellschicht nicht-invasiv und mit guter Zeitauflösung untersucht.
Das erste Projekt befasste sich mit der Detektion des Sauerstoffverbrauchs von adhärenten Säugetierzellmonoschichten. Zur Bearbeitung dieser Problemstellung wurde in Zusammenarbeit mit der Firma PreSens GmbH, Regensburg, ein auf einer Mikroskopoptik basierendes Kamerasystem (VisiSens TD mic) entwickelt. Das Messsystem lässt sich in ein normales Zellkulturinkubationssystem (48 l) integrieren und ermöglicht die Bildgebung der räumlichen und zeitlichen Sauerstoffverteilung mit hoher Auflösung. Als Wachstumssubstrate wurden polymer-basierte, sauerstoffempfindliche Folien (SF-RPSu4, PreSens GmbH) verwendet, die eine ratiometrische Quantifizierung des Sauerstoffgehalts unterhalb der Zellschicht ermöglichten. Eine Nutzung der Sensorfolien für Langzeitstudien an Zellen war aufgrund der hohen Photostabilität, der geringen Phototoxizität und einer guten Biokompatibilität möglich. Das neu entwickelte Messsystem wurde für erste Beispielstudien verwendet. Versuche zur Abhängigkeit der Sauerstoffverbrauchsraten in Abhängigkeit vom Mediumvolumen und der Zellaussaatdichte zeigten reproduzierbare Ergebnisse. Darüber hinaus konnte der Einfluss des extrazellulären pH-Werts, sowie der Effekt von Toxinen und pharmakologischen Substanzen auf den Sauerstofferbrauch von NRK und MDCK II Zellen erfolgreich nachgewiesen werden. Zudem wurde die hohe räumliche Auflösung der Kamera für die Abbildung eines Sauerstoffgradienten verwendet, der durch einen isolierten Patch metabolisch aktiver Zellen verursacht wurde.
Die zeitgleiche Erfassung von mehreren Parametern mit Hilfe eines dualen Sensors ist ein nützlicher Ansatz, um den Informationsgewinn einer Messung zu erhöhen. Daher fokussierte sich das zweite Projekt auf die Kombination von optischen Sauerstoffsensoren und Impedanzanalyse (ECIS-O2) zur Vermessung von adhärenten Zellschichten. Hierfür wurden lineare Goldfilmelektroden mit Hilfe einer Maske auf planare, sauerstoffsensitive Substrate abgeschieden. Eine auf den Sensor aufgeklebte PDMS Kammer diente zur Zellkultivierung. Der duale Sensor ermöglicht eine gleichzeitige, zeitaufgelöste Messung der Impedanz zur Untersuchung der Zellmorphologie und der ratiometrischen Fluoreszenz-Emission zur Bestimmung des Sauerstoffverbrauchs. Die Kombination der ratiometrischen Sauerstoffbestimmung mit dem impedimetrischen Ausleseverfahren ermöglichte die Korrelation von Zellstoffwechselaktivität und Änderungen der Zellmorphologie. Der duale ECIS-O2 Sensor wurde hinsichtlich von Parametern wie Biokompatibilität, Signalstabilität und der sensitiven Frequenzen zur Impedanzmessung charakterisiert. Erste Studien ermöglichten das simultane Auslesen des Sauerstoffverbrauchs und der Impedanz während der Adhäsion von MDCK II Zellen. Darüber hinaus wurde der duale Sensor verwendet, um den Einfluss von Entkopplern und Blockern der Zellatmung zu untersuchen.
Multizelluläre Tumorsphäroide sind 3D Gewebemodelle, die als nützliche Werkzeuge für in vitro Studien in der klinischen Forschung angesehen werden. Aufgrund ihrer dreidimensionalen Struktur bilden sie den Brückenschlag zwischen 2D Zellmonoschichten und nativem Gewebe. Durch ihren Aufbau entspricht die Physiologie von multizellulären Sphäroiden mehr der von Geweben, während ihre Kultivierung wesentlich einfacher ist als die von Gewebe. Es gibt nur wenige Studien, die über den Sauerstoffgehalt in lebenden Sphäroiden berichten. Gängige Methoden zur Untersuchung des Sauerstoffgehalts sind zumeist endpunktbasiert, führen zum Absterben Zellen während der Messung oder sind struktur-invasiv, wie beispielsweise das Einbringen von Mikroelektroden oder Nanopartikeln in das Sphäroid. Aus diesem Grund wurde im Rahmen des dritten Projekts der Sauerstoffverbrauch von MCF-7 Tumorsphäroiden mit Hilfe des neu entwickelten, mikroskopoptik-basierten Detektionssystems quantitativ untersucht. Hierfür wurden die Sphäroide auf planaren, biokompatiblen Sauerstoffsensorfolien kultiviert. Die zunächst sphärischen Sphäroide bilden nach Adhäsion auf den Folien semi-sphärische Strukturen, deren Sauerstoffgehalt mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung nachverfolgt werden konnte. Der Messaufbau erlaubte eine wesentlich detailliertere Darstellung der räumlichen Sauerstoffverteilung, im Vergleich zu etablierten, bildgebenden Sauerstoffdetektionssystemen. So konnten Sauerstoffgradienten innerhalb der Sphäroide, verursacht durch die metabolisch aktiven Zellen im Sphäroid, über Stunden bis Tage vermessen werden. Des Weiteren konnten mit Hilfe des neuen Messsystems die Wirkung verschiedener Testsubstanzen auf die zeitliche und räumliche Sauerstoffverteilung untersucht werden. Hierfür wurde beispielshaft die oxidative Phosphorylierung der Sphäroide mit Pharmaka entkoppelt oder blockiert, was zu einem Anstieg oder Zusammenbruch des Sauerstoffgradienten zwischen Peripherie und Zentrum des Sphäroids führte.
Wundheilungsassays sind ein beliebtes Mittel zur Untersuchung von kollektiver Zellmigration unter in vitro Bedingungen. Hierfür wird eine künstliche Wunde in eine Zellmonoschicht eingebracht und die Migration von benachbarten Zellen in die Wunde untersucht. Im Rahmen des vierten Projekts wurde ein neuer Wundheilungsassay basierend auf sauerstoffempfindlichen Kultursubstraten entwickelt. Planare, polymer-basierte Schichten mit eingebetteten, sauerstoffsensitiven Farbstoffen wurde mittels Schleuderbelackung auf Deckgläschen hergestellt. Die so hergestellten transparenten Komposit-Substrate erlauben sowohl eine direkte Kultivierung von adhärenten Zellen an der Oberfläche, als auch lichtmikroskopische Studien. Die Verwundung erfolgt durch eine gezielte Anregung der Farbstoffmoleküle im Substrat. Durch das Prinzip der Lumineszenzlöschung wird Singulettsauerstoff erzeugt, der die Zellen im belichteten Bereich gezielt abtötet. Die funktionalisierten Substrate wurden hinsichtlich ihrer Biokompatibilität analysiert und der Einfluss von Parametern wie Lichtquelle, Belichtungsdauer, Belichtungsintensität oder Art des Kulturmediums wurde untersucht. Der neue optische Assay wurde mit etablierten Methoden wie dem Scratch, Barriere oder ECIS® Assay hinsichtlich Kosten, Durchsatz, Reproduzierbarkeit oder Wundmorphologie verglichen. Der neuartige Assay wurde zudem verwendet, um das Wundheilungsverhalten von Epithelzellen unter Einfluss von Faktoren wie verändertem extrazellulärem pH-Wert oder Serumentzug, sowie unter Einwirkung des Mycotoxins Cytochalasin D zu untersuchen.
Metadaten zuletzt geändert: 25 Nov 2020 20:30
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