Analysis of the Immune Cell Infiltrates and Biomarkers during acute Gastrointestinal Graft vs Host Disease

URN zum Zitieren dieses Dokuments:: urn:nbn:de:bvb:355-epub-349997
DOI zum Zitieren dieses Dokuments:: 10.5283/epub.34999

Ghimire, Sakhila

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Veröffentlichungsdatum dieses Volltextes: 22 Dez 2016 05:43

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Dokumentenart:	Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation)
Open Access Art:	Primärpublikation
Seitenanzahl:	138
Datum:	22 Dezember 2017
Begutachter (Erstgutachter):	Prof. Dr. Ernst Holler
Tag der Prüfung:	12 Dezember 2016
Institutionen:	Medizin > Lehrstuhl für Innere Medizin III (Hämatologie und Internistische Onkologie)
Stichwörter / Keywords:	GvHD, T regs, ILCs, mikrobiome
Dewey-Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Status:	Veröffentlicht
Begutachtet:	Ja, diese Version wurde begutachtet
An der Universität Regensburg entstanden:	Ja
Dokumenten-ID:	34999

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Zusammenfassung (Englisch)

Zusammenfassung (Englisch)

Our understanding in GvHD biology has advanced substantially; yet, the pathophysiology of gut GvHD is poorly understood partially due to the lack of gut biopsies for research and the difficulties to directly translate data from murine experiments into humans. The aim of this dissertation was therefore to analyze immune cell infiltrates and biomarkers in gut biopsies of patients after allogenic stem cell transplantation and to explain some of the newer findings on the role of the microbiome by analyzing bacterial metabolites in vitro .
CD4+ T cells and CD8+ T cells were analyzed by means of single antibody immunohistochemistry (IHC). CD4+ T cells were found to be correlated with CD8+ T cell infiltration and epithelial apoptosis whereas CD8+ T cells were upregulated in GvHD and correlated with crypt loss and epithelial apoptosis confirming the primacy of T cell infiltrates in development and exacerbation of GvHD.
Foxp3+ and IDO+ cells were analyzed by IHC in gut biopsies of ASCT patients and the respective mRNA expression was analyzed by qPCR. Both Foxp3+ cells and IDO+ cells significantly upregulated at protein and mRNA level with exacerbation of GvHD, and, Foxp3 and IDO expression strongly correlated to each other suggesting an immunoregulatory loop reactively activated to dampen the T cell response. Using double immunofluorescence, existence of both, the expected CD4+Foxp3+ and the new population of CD8+ Foxp3+ Tregs were discovered which may be crucial for GvHD resolution.
IL-17+ cells were analyzed by IHC and immunofluorescence in colon biopsies of ASCT patients which were significantly downregulated in GvHD. In line with protein expression, the transcription factor RORC significantly downregulated in GvHD. Double immunofluorescence depicted these cells are non T cells but co-express CD117 (c-kit) confirming the innate origin of IL-17+ cells, more likely to be type 3 innate lymphoid cells. This suggests that IL17+ cells beyond TH17 cells exist also in humans which may be protective in GvHD by production of protective IL22.
First phase of gene profiling revealed four possible candidate genes: CYP27A1, CYP27B1, VDR and PXR that were highly regulated in GvHD and two genes: VDR and CYP27A1 could be a future biomarker. The predominance of Vitamin D dependent genes as significant biomarkers in GI tissue further supports the central role of immunoregulation in GvHD related inflammation.
As many of these regulatory loops are activated by the interplay between intestinal microbiota and immune cells, we revealed the importance of bacterial metabolite indoxyl sulfate as a potential immunomodulator that inhibited maturation and activation of human monocyte-derived dendritic cells in vitro.
In summary, our data underline that GvHD is a result of an imbalance between alloreactive T cells and protective regulatory cells and ILCs. Strategies aiming to restore immunoregulation are of central importance and may be either applied directly or by changing the balance of microbiota as bacterial metabolites play a major role in intestinal immunoregulation.

Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)

In der Pathophysiologie der GvHD stand bis vor kurzem die Aktivierung alloreaktiver zytotoxischer T Zellen des Spenders durch major und minor HLA Antigene des Empfängers im Vordergrund. In einer ersten Phase werden diese auf Empfänger Antigenpräsentierenden Zellen nach Aktivierung durch die Konditionierung und Danger Associated Patterns stimuliert. In der Effektorphase werden die Targetorgane der GvHD über zytotoxische Mechanismen, aber auch über FasL und von CD4 Zellen produzierte proinflammatorische Zytokine geschädigt. Natürliche regulatorische T Zellen können die Entstehung der GvHD verhindern bzw abschwächen.

Die exakte Rolle der Immunregulation und der beteiligten Zellpoulationen im Patienten bei der GvHD ist z.T. durch die Schwierigkeit der Untersuchungen von Biopsien, aber auch durch die mangelnde Übertragbarkeit aus dem Mausmodell bisher unzureichend charakterisiert. Ziel dieser Arbeit war es deshalb, an einer großen Serie intestinaler Biopsien mittels Immunhistologie und -fluoreszenz sowie auf mRNA Ebene die regualatorischen Zellpopulationen genauer zu untersuchen und als möglichen Mechanismus der Immurnegaulation die Interaktion eines von der Arbeitsgruppe diagnostisch beschriebenen bakteriellen Metaboliten mit Immunzellen zu chrakterisieren.

Die Dominanz zytotoxischer T Zellen konnte durch die Korrelation der CD8 Infiltrate mit der Apoptose bestätigt warden, CD4 Zellen waren im Sinne einer T-Zellhilfe damit assoziiert.

Anders als erwartet waren Foxp3 positive Zellen und die Foxp3 mRNA bei Auftreten einer GvHD heraufreguliert. In Zusammenschau mit der gleichzeitigen Aktivierung IDO positive Zellen muss von einer immunregulatorischen Reaktion auf die T-Zellaktivierung ausgegangen warden. Als neue Population wurden neben den bekannten CD4+Foxp3+ Zellen auch CD8+Foxp3+ Zellen beschreiben, die als regulatorische Zellen im intestinalen Gewebe bei anderen Erkrankungen bekannt sind.

Entgegen der Erwartungen waren IL17 positive Zellen bei der GvHD vermindert. Das Paradoxon, dass TH17-Zellen bei der GvHD vermehrt sein sollten, konnte dadurch aufgeklärt warden, dass die IL17+ Zellen keine T Zellmarker trugen, sondern dass sie wegen der Positivität für cKit vermutlich Innate Lymphoid Cells vom Typ 3 sind. Die verminderte Expression des Transkriptionsfaktors RoRy unterstützt diese Befunde.Diesen Zellen wird eine wichtige Rolle bei der Dämpfung der intestinalen Inflammation, vermutlich über IL22, zugeschrieben.

In der Genexpressionsanalyze stachen Enzyme des Vit D Stoffwechels sowie der VitDR als prognostische Marker hervor, was die zentrale Rolle der Immunregulation bei der intestinalen GvHD weiter unterstreicht.

Viele dieser regulatorischen Mechansimen warden durch die Interaktion mit dem intesitnalen Mikrobiom aktiviert. In der Untersuchung des in der Diagnostik wichtigen Indoxlysulfats konnte gezeigt werden, dass dieser Metabolit die Aktivierung von Immunzellen supprimiert und zur Immunregaultion über IL10 führt.

Zusammenfassend zeigen diese Untersuchung auf mehreren Ebenen, dass die GvHD als Dysblance zwischen Aktivierung zytotoxischer T Zellen und der Suppression regulatorischer Populationen wie T regs und ILCs verstanden werden kann. Die Entwicklung von Strategien zur Wiederherstellung der Immunregulation scheint von zentraler Bedeutung für die Verbesserung der GvHD Porphylaxe und Therapie zu sein. Dies kann entweder direkt geschehen oder durch Wiederherstellung einer balanzierten Zusammensetzung der intestinalen Mikrobiota, deren Metabolite einen erheblichen Anteil an der intestinalen Immunregulation tragen.

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