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- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-326437
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 23 Oktober 2015 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Prof. Dr. Dr. André Gessner |
| Tag der Prüfung: | 20 Oktober 2015 |
| Institutionen: | Medizin > Lehrstuhl für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene |
| Stichwörter / Keywords: | soxS, E. coli, Antibiotika-Efflux |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 32643 |
Zusammenfassung (Deutsch)
Ein häufiges Problem im klinischen Alltag sind die zunehmenden Resistenzen verschiedener Bakterien gegenüber Antibiotika. Im Rahmen einiger wissenschaftlicher Arbeiten zu diesem Themenkomplex wird angenommen, dass auch die Proteine SoxS und SoxR eine Rolle bei der Vermittlung von Resistenzen bei E. coli spielen (Miller & Sulavik, 1996). Es wird vermutet, dass es sich bei dem Protein SoxS um ...
Zusammenfassung (Deutsch)
Ein häufiges Problem im klinischen Alltag sind die zunehmenden Resistenzen verschiedener Bakterien gegenüber Antibiotika. Im Rahmen einiger wissenschaftlicher Arbeiten zu diesem Themenkomplex wird angenommen, dass auch die Proteine SoxS und SoxR eine Rolle bei der Vermittlung von Resistenzen bei E. coli spielen (Miller & Sulavik, 1996).
Es wird vermutet, dass es sich bei dem Protein SoxS um einen Transkriptions-Aktivator in Escherichia coli handelt, welcher Gene stimuliert, die wiederum zu einer erhöhten Resistenz gegenüber oxidativem Stress und verschiedenen Antibiotika führen. Um die Transkription dieser Gene zu aktivieren, wird SoxS selbst durch die aktive Form von SoxR in seiner Struktur modifiziert. Die damit angestoßene Kaskade könnte zu einer gesteigerten Virulenz einer bakteriellen Infektion mit E. coli führen (Demple, 1996). Die Regulationseinheit aus SoxR und SoxS stellt auch ein Superoxid-Abwehrsystem dar, welches hierdurch an einer möglichen, sich ausbildenden Multiresistenz von E. coli beteiligt ist (Li & Demple, 1994; Amábile-Cuevas & Arredondo-García, 2013).
In dieser Arbeit sollte nun speziell das Regulon SoxRS und dessen Einfluss auf Effluxpumpen der Bakterienwand näher untersucht werden. Auch die Bedeutung oxidativen Stresses, welcher in dieser Arbeit durch Paraquat simuliert wurde, auf die Expression von soxS und soxR sowie auf verschiedene Effluxpumpen wurde näher untersucht. Die möglicherweise angestoßenen Veränderungen wurde dabei sowohl auf genotypischer Ebene mittels real time-PCR als auch auf phänotypischer Ebene mittels MHK-Testungen mit verschiedenen Antibiotika erfasst.
Im Rahmen von Vorarbeiten zu diesen Versuchen wurden verschiedene Klone generiert, um die mögliche Auswirkung konklusiv auf ihre tatsächliche im Genom zu Grunde liegende Ursache zurückführen zu können. Dabei wurde die Genomsequenz, welche für den Abschnitt soxS kodiert u.a. zusammen mit dem Locus soxR sowohl in high copy-Plasmide als auch in mittels Arabinose-Zugabe in ihrer Kopienzahl steuerbare low copy-Plasmide kloniert. Zudem wurde der Genlocus soxS in einem neu konstruierten Plasmid entkoppelt von soxR unter die Kontrolle des Genomabschnitts für den Promotor lac gestellt. Darüber hinaus wurden auch Versuche mit inverser Orientierung des Genomabschnitts soxRS in diesen Plasmiden unternommen, um die mögliche Relevanz der Orientierung zu überprüfen.
Bei der Auswertung der real time-PCR zeigte sich, dass die Orientierung von soxRS eine wesentliche Rolle hinsichtlich des zu verzeichnenden Anstiegs der Expressionsrate spielt. Die Relevanz des Genomabschnitts soxS hinsichtlich der Reaktion auf Superoxide als Stressoren zeigte sich eindrücklich in dem deutlichen Anstieg der Expressionsrate von soxS und soxR unter dem Einfluss von Paraquat.
Des Weiteren wurden ausgehend von soxS und soxR die möglichen Veränderungen der Transkriptionsmenge verschiedener Proteine der Signaltransduktion (MarA, SdiA) sowie Proteine, die Effluxpumpen (AcrAB-TolC-Pumpenkomplex, MdfA, NorE) oder Porine der Zellwand (OmpF) bilden, untersucht. Für diese zusätzlich untersuchten Proteine ließen sich jedoch im Vergleich zum unveränderten Plasmidkonstrukt keine signifikanten Expressionsunterschiede für das jeweilige Gen feststellen. Neben der Erfassung genotypischer Veränderungen wurden auch Untersuchungen möglicher phänotypischer Veränderungen durch Testungen der generierten Konstrukte auf ihre jeweilige MHK gegenüber verschiedenen Antibiotika durchgeführt. Aus mehreren wissenschaftlichen Publikationen war bekannt, dass speziell bei Fluorochinolonen der Efflux aus dem Bakterium die Hauptursache einer verminderten Akkumulation dieser Medikamente im Bakterium darstellt (Piddock, 1999). Neben einer Reihe von Fluorochinolonen wurden an den in dieser Arbeit generierten Konstrukten auch MHK-Veränderungen bei Versuchen mit Imipenem und Doxycyclin erfasst. Für die Konstrukte mit dem low copy-Plasmid waren - bis auf zwei Ausnahmen - keine signifikanten Veränderungen nachweisbar, während die Konstrukte mit dem high copy-Plasmid pUC19 fast durchweg einen signifikanten Anstieg der MHK gegenüber Fluorochinolonen und Doxycyclin zeigten. Darüber hinaus wurden alle MHK-Versuche parallel auch auf mit Paraquat vorbehandelten Platten durchgeführt. Durch diese zusätzliche Induktion konnten jedoch nur noch in geringen Umfang weitere Anstiege MHK erfasst werden.
Während die phänotypischen Ergebnisse dieser Arbeit sich mit den in verschiedenen wissenschaftlichen Publikationen beschriebenen Ergebnissen einer Zunahme der MHK in Bezug auf die ausgewählten Antibiotika decken, konnte eine alleinige Induktion verschiedener Proteine der Signaltransduktion und ausgewählter Effluxpumpen durch das Regulon SoxRS auf genotypischer Ebene nicht nachgewiesen werden.
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
An increase of different bacteria resistant against antibiotics has become daily routine in clinics. Scientific puplications concerning this field come to the conclusion that the proteins SoxS and SoxR play a role in mediating resistance in E. coli (Miller & Sulavik, 1996). It is assumed that the protein SoxS is an activator of transcription in Escherichia coli, which stimulates genes that are ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
An increase of different bacteria resistant against antibiotics has become daily routine in clinics. Scientific puplications concerning this field come to the conclusion that the proteins SoxS and SoxR play a role in mediating resistance in E. coli (Miller & Sulavik, 1996).
It is assumed that the protein SoxS is an activator of transcription in Escherichia coli, which stimulates genes that are responsible for an increased resistance against oxidative stress and several antibiotics. The transcription of these genes is the result of a structural modification of SoxS by the active form of SoxR. The cascade thus initiated could lead to an increased virulence of an E. coli infection (Demple, 1996). The regulatory unit consisting of SoxR and SoxS is also a defence mechanism against superoxide, which is part of a possibly developing multi resistance in E. coli (Li & Demple, 1994; Amábile-Cuevas & Arredondo-García, 2013).
This thesis was focused on the SoxRS regulon and its influence on the efflux pumps in the bacterial cell wall. Moreover the impact of oxidative stress, which was simulated by Paraquat, on the expression of soxS and soxR was scrutinized. Potentially induced changes were detected on a genomic scale via real-time PCR as well as phenotipically by tests of the MIC with different antibiotics.
To obtain conclusive answers about the genomic reasons for those effects, several clons were created in preliminary experiments. The genomic sequence coding for soxS was cloned amongst others in combination with the soxR locus into high copy plasmids as well as into low copy plasmids, whose activity can be regulated via addition of arabinose. In addition a new plasmid with soxS controlled by the lac promotor independent of soxR was constructed. To check for a possible relevance of the orientation further experiments were done with an inverse orientation of the soxRS region in those plasmids.
The evaluation of the real time PCRs indicated an essential role of the orientation of soxRS for the measured increase in expression rates. The relevance of the gene soxS concerning the reaction towards super oxide as a stressor is clearly shown by a significant increase in the expression rates of soxS and soxR under the influence of Paraquat.
Moreover possible changes in the transcription rate of proteins responsible for signal transduction (MarA, SdiA), formation of efflux pumps (AcrAB-TolC complex) and cell wall porins (OmpF) were investigated, based on the expression of soxS and soxR. No significant changes in gene expression were found for these proteins in comparison to the unmodified plasmid construct. Besides genetic changes it was tested for potential changes in phenotype by checking the MIC of different antibiotics in these constructs. It is know from literature that especially for fluorochinolons efflux from the bacterium is the main reason for a decrease in accumulation of these pharmaceuticals in bacteria (Piddock, 1999). It was also investigated in this thesis whether the generated constructs resulted in changes of the MIC of Imipenem and Doxycylin in addition to a series of fluorochinolons. Constructs containing low copy plasmids did not result in significant changes wheras constructs containing the high copy plasmid pUC19 almost always decreased the sensitivity against fluorochinolons and doxycycline. Furthermore all tests were run with paraquat pretreated plates in parallel.This extra stimulus had no further significant effect on the MIC.
While the phenotypic results of this work are in accordance with published results concerning an increase in antibiotic resistance, the sole induction of different signal transducing proteins and selected efflux pumps by the SoxRS regulon could no be proven on the genotypic level.
Metadaten zuletzt geändert: 25 Nov 2020 15:36
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