| Lizenz: Veröffentlichungsvertrag für Publikationen ohne Print on Demand (5MB) |
- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-290166
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.29016
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 12 November 2014 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Prof. Dr. Herbert Tschochner |
| Tag der Prüfung: | 11 November 2013 |
| Institutionen: | Biologie und Vorklinische Medizin > Institut für Biochemie, Genetik und Mikrobiologie > Lehrstuhl für Biochemie III > Prof. Dr. Herbert Tschochner |
| Stichwörter / Keywords: | RNA polymerase, termination, elongation, in vitro, nucleosome, Reb1, Nsi1, Fob1, S. cerevisiae, yeast, transcription, Pol I, Pol II, Pol III |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 29016 |
Zusammenfassung (Englisch)
In Saccharomyces cerevisiae (hereafter called yeast), three RNA polymerases synthesize the nuclear transcriptome. During the transcriptional cycle, RNA polymerase I, II and III (Pol I, II and III) are recruited to their respective promoter, elongate the nascent transcript in the context of chromatin and finally terminate transcription. Whereas the initation step is quite well understood, our ...
Zusammenfassung (Englisch)
In Saccharomyces cerevisiae (hereafter called yeast), three RNA polymerases synthesize the nuclear transcriptome. During the transcriptional cycle, RNA polymerase I, II and III (Pol I, II and III) are recruited to their respective promoter, elongate the nascent transcript in the context of chromatin and finally terminate transcription. Whereas the initation step is quite well understood, our knowledge about elongation and termination is very limited. Therefore, we developed an in vitro transcription system in which elongation and termination of RNA Pol I can be analyzed independent of promoter-specific initiation. The same transcription system allowed comparison of the three RNA polymerases regarding their behaviour, if barriers are encountered during elongation. In summary, the following questions were addressed:
1) Several DNA cis elements and trans-acting factors are described to support RNA Pol I dependent transcription termination. Among the protein factors are the Reb1 homolog Ydr026c/Nsi1 which was recently found to be required for efficient Pol I termination in vivo, Reb1, which terminates transcription in vitro and the replication fork blocking protein Fob1. We further investigated the role of these factors in the termination process regarding i) the role of Nsi1 and other possible trans-acting factors and ii) the influence of mutations in Pol I subunits in transcription termination. We found that Nsi1 imposed an elongation barrier for Pol I. Furthermore, we could show that presence of the 35S rDNA terminator-proximal Reb1 binding site was sufficient for Nsi1-dependent Pol I pausing/termination in vitro which was further enhanced by the T-rich 1 element. In addition, our data suggest that Nsi1 and Fob1 exhibit a cooperative effect in Pol I transcription termination in vitro.
2) We further wanted to elucidate whether RNA Pol I, II and III deal differently with elongation obstacles in general. Thus, we comparatively analyzed Pol I, II and III transcription of templates complexed with the physiological elongation barriers Nsi1, Reb1 and Fob1 in vitro. Furthermore, the unphysiological bacterial strong DNA-binding proteins LexA and LacI as well as the mouse rDNA terminaton factor TTF-I were included in the analysis. We could show that Nsi1 and Reb1 were specifically impairing Pol I transcription elongation. Contrary, LexA only imposed a road-block for Pol II. On the other hand, TTF-I was an elongation obstacle for all three RNA polymerases.
3) In all eukaryotic cells, gene transcription occurs in the context of chromatin. Chromatin is a complex assembly of DNA and DNA bound proteins, with histone molecules forming the abundant, basic unit of chromatin, the nucleosome. It is of great importance to understand how the different RNA polymerases cope with the chromatin template. It has been suggested, that actively transcribed Pol I and III genes are devoid of nucleosomes, whereas Pol II genes are nucleosomal. To analyze whether the RNA polymerases have intrinsic activities to deal differently with the nucleosomal templates, we comparatively investigated Pol I, II and III transcription elongation on templates complexed with nucleosomes in vitro. Many studies employing in vitro assays have already analyzed chromatin transcription by the different RNA Pols. However, it is hard to compare the individual results, since the respective in vitro systems used for analysis often differ significantly in many aspects, whereas side-by-side comparison of Pol I, II and III is possible in our system. Furthermore, we used RNA Pol I mutants to elucidate the contribution of certain subunits to transcribe through nucleosomal templates. We observed that Pol I and III were able to transcribe a nucleosomal template in vitro, whereas in agreement with the literature a single nucleosome imposed a very strong barrier for Pol II elongation. Additionally, we could demonstrate that subunit A49 significantly contributes to Pol I’s ability to overcome the nucleosomal barrier.
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
In S. cerevisiae synthetisieren drei RNA Polymerasen das Transkriptom des Nukleus. Während eines Transkriptionszyklus werden die RNA Polymerasen I, II und III (Pol I, II und III) an ihren jeweiligen Promotor rekrutiert, synthetisieren die entstehende RNA und terminieren die Transkription schlussendlich. Der Prozess der Initiation ist bereits ausführlich beschrieben, wohingegen unser Wissen über ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
In S. cerevisiae synthetisieren drei RNA Polymerasen das Transkriptom des Nukleus. Während eines Transkriptionszyklus werden die RNA Polymerasen I, II und III (Pol I, II und III) an ihren jeweiligen Promotor rekrutiert, synthetisieren die entstehende RNA und terminieren die Transkription schlussendlich. Der Prozess der Initiation ist bereits ausführlich beschrieben, wohingegen unser Wissen über die Teilschritte Elongation und Termination sehr begrenzt ist. Daher entwickelten wir ein in vitro Transkriptionssystem, in welchem es möglich ist, Elongation und Termination der RNA Pol I unabhängig von Promotor-spezifischer Initiation zu analysieren. Das selbe System ermöglichte uns den Vergleich der drei RNA Polymerasen hinsichtlich ihres Verhaltens gegenüber Elongationsbarrieren. Zusammenfassend wurden die folgenden Fragen adressiert:
1) Verschiedene DNA cis-Elemente und in trans agierende Faktoren wurden in Zusammenhang mit der Termination von RNA Pol I beschrieben. Unter den Proteinfaktoren sind das zu Reb1 homologe Protein Ydr026c/Nsi1, das kürzlich als notwendiger Faktor für effiziente Pol I Termination beschrieben wurde, Reb1, das Pol I Transkription in vitro terminiert und Fob1, welches die Replikationsgabel blockiert. Wir analysierten die Rolle dieser Faktoren im Terminationsprozess hinsichtlich i) der Rolle von Nsi1 und der anderen möglichen in trans agierenden Faktoren und ii) des Einflusses von Mutationen in den Untereinheiten von Pol I. Wir zeigten, dass Nsi1 eine Elongationsbarriere für Pol I darstellt. Zusätzlich konnten wir zeigen, dass die Anwesenheit der am Terminator der 35S rDNA gelegenen Reb1 Bindestelle ausreichend war, um RNA Pol I in vitro zu terminieren/pausieren. Dieser Effekt wurde durch die Anwesenheit des T-rich Elements verstärkt. Weiterhin weisen unsere Daten auf einen kooperativen Effekt zwischen Fob1 und Nsi1 in der Termination der Transkription von Pol I in vitro hin.
2) Wir wollten weiterhin analysieren, ob RNA Pol I, II und III im Allgemeinen unterschiedlich mit Elongationsbarrieren interagieren. Daher studierten wir die Transkription von DNA Matrizen, die mit den physiologischen Elongationsbarrieren Nsi1, Reb1 und Fob1 komplexiert waren, in vitro. Zusätzlich inkludierten wir die unphysiologischen starken bakteriellen DNA-Bindeproteine LexA und LacI und den rDNA Terminationsfaktor TTF-I der Maus. Wir konnten zeigen, dass Nsi1 und Reb1 spezifisch die Transkription der RNA Polymerase I inhibierten. Im Gegensatz dazu blockierte LexA nur Pol II. Andererseits fanden wir, dass TTF-I eine Elongationsbarriere für alle drei RNA Polymerasen darstellte.
3) In allen eukaryotischen Zellen findet die Transkription der Gene im Chromatinkontext statt. Chromatin ist ein komplexes Konglomerat, bestehend aus DNA und DNA-bindenden Proteinen. Dabei bilden Histone die grundlegende Einheit des Chromatins, das Nukleosom. Es ist sehr wichtig zu verstehen, wie die verschiedenen RNA Polymerasen mit der Chromatinmatrize umgehen. Es wurde vorgeschlagen, dass aktiv transkribierte Gene von Pol I und III wenige oder keine Nukleosomen beinhalten, wohingegen Pol II Gene nukleosomal sind. Um zu analysieren, ob die RNA Polymerasen unterschiedliche intrinsische Aktivität haben um mit nukleosomalen Matrizen umzugehen, studierten wir die Elongation von RNA Pol I, II und III auf nukleosomalen DNA-Matrizen in vitro. Viele in vitro Studien haben sich bereits mit der Transkription von Chromatin beschäftigt. Allerdings ist es schwierig die verschiedenen Resultate zu vergleichen, weil die verwendeten experimentellen Systeme sehr divergent waren, wohingegen der Vergleich von RNA Pol I, II und III in unserem System möglich ist. Zusätzlich verwendeten wir Pol I Mutanten um den Einfluss von einzelnen Unterheinheiten auf den Transkriptionsprozess im Chromatinkontext zu untersuchen. Wir fanden heraus, dass Pol I und III eine nukleosomale Matrize in vitro transkribieren können, wohingegen (im Einklang mit der Literatur) ein Nukleosom eine sehr starke Barriere für Pol II darstellte. Zusätzlich konnten wir zeigen, dass die Untereinheit A49 einen wesentlichen Beitrag zur Transkription einer nukleosomalen Matrize durch Pol I leistet.
Metadaten zuletzt geändert: 26 Nov 2020 01:40
Nur für Besitzer und Autoren: Kontrollseite des Eintrags
Downloadstatistik