| Lizenz: Veröffentlichungsvertrag für Publikationen ohne Print on Demand (1MB) |
- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-286560
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.28656
Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
---|---|
Open Access Art: | Primärpublikation |
Datum: | 6 August 2013 |
Begutachter (Erstgutachter): | PD Dr. Sebastian Hahnel |
Tag der Prüfung: | 23 Juli 2013 |
Institutionen: | Medizin > Lehrstuhl für Zahnärztliche Prothetik |
Stichwörter / Keywords: | Resazurin-Reduktions-Methode, Cytox Violet, Streptokokkus mutans |
Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin |
Status: | Veröffentlicht |
Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
Dokumenten-ID: | 28656 |
Zusammenfassung (Deutsch)
Ein wichtiges Forschungsthema in der Zahnmedizin befasst sich mit der Adhäsion von Mikroorganismen an Zahnersatzmaterialien. Dabei sind v.a. kariesverursachende Leitkeime (wie Streptococcus mutans) von Interesse. Einen wichtigen Ansatz stellt dabei die Entwicklung von Restaurationsmaterialien, die eine geringe Adhäsion von Bakterien gewährleisten, dar. Diese wird zumeist in Versuchen in vitro ...
Zusammenfassung (Deutsch)
Ein wichtiges Forschungsthema in der Zahnmedizin befasst sich mit der Adhäsion von Mikroorganismen an Zahnersatzmaterialien. Dabei sind v.a. kariesverursachende Leitkeime (wie Streptococcus mutans) von Interesse. Einen wichtigen Ansatz stellt dabei die Entwicklung von Restaurationsmaterialien, die eine geringe Adhäsion von Bakterien gewährleisten, dar. Diese wird zumeist in Versuchen in vitro bestimmt.
Für derartige Versuche in vitro sind effiziente und präzise Quantifizierungsmethoden von Bedeutung. Hierbei wird v.a. auf eine einfache und zeitsparende Anwendung sowie möglichst wenige anfallende Abfallprodukte geachtet. Eine sehr anerkannte Methode für Versuche in vitro stellen Fluoreszenzfarbstoffe dar, die ursprünglich für Viabilitätsuntersuchungen, wie z.B. von Bakterien in Kuhmilch, gedacht waren, sich aber auch als Methode zur Quantifizierung der in Biofilm organisierten Mikroorganismen in Mikrotiterplatten durchgesetzt haben. Von besonderer Bedeutung für die Quantifizierung von Bakterien sind Fluoreszenzfarbstoffe, die nur die lebenden Bakterien erfassen. Ein solcher, neuerer Farbstoff ist Cytox Violet®, dessen Eigenschaften im Rahmen dieser Arbeit untersucht werden sollten. Cytox Violet® wurde in verschiedenen Versuchsaufbauten mit der im biologischen Labor der Poliklinik für zahnärztliche Prothetik der Universität Regensburg bereits etablierten konventionellen Resazurin-Reduktionsmethode verglichen. Als Bakterienstamm wurde Streptococcus mutans ausgewählt, da dieser nachgewiesenermaßen eine wesentliche Rolle bei der Entstehung von Karies spielt.
Im ersten Teil dieser Arbeit wurden hierfür zunächst die Farbstoffkonzentrationen für drei unterschiedliche Quantifizierungsmethoden ausgewählt. Die erste Quantifizierungsmethode stellt dabei die konventionelle Resazurin-Reduktionsmethode (Methode A) dar. Bei dieser Methode wird das Resazurin während der Simulation der Biofilmbildung inkubiert. Bei der zweiten Quantifizierungsmethode wurde Resazurin erst nach bereits stattgefundener Adhäsion des S. mutans inkubiert (Methode B). Für die dritte Quantifizierungsmethode wurde der Farbstoff Cytox Violet® verwendet (Methode C), der auch erst nach der Bakterienadhäsion zugegeben wurde. Die Versuche wurden mit verschiedenen Farbstoffkonzentrationen mit den Probematerialien Glas, Polyethylen und Palapress vario durchgeführt. Es wurde eine Farbstoffkonzentration von 15 µl Resazurin pro ml PBS bzw. Bakterienlösung und 20 µl Cytox Violet® pro 200 µl PBS ausgewählt.
Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden die drei Quantifizierungsmethoden mit der festgelegten Farbstoffkonzentration jeweils mit und ohne vorherige Pellikelbildung in einem semistatischen Versuchsaufbau untersucht. Die Probematerialien entsprachen denen des ersten Versuchsaufbaus. Bei diesem Versuchsaufbau wurde von den Prüfkörpern, bei denen jeweils die höchste und die niedrigste Fluoreszenzintensität gemessen wurde, eine rasterelektronenmikroskopische Aufnahme mit 1700-facher und 3800-facher Vergrößerung erstellt. Dies geschah, um eine optische Kontrolle der Bakterienanlagerung zu gewährleisten. Mit einem Computerprogramm wurde anhand dieser Bilder die mit Bakterien bedeckte Oberfläche in Prozent ermittelt. Die Ergebnisse der drei Quantifizierungsmethoden fielen im zweiten Teil sehr unterschiedlich aus. Während bei Methode A weder ein Einfluss des Materials, noch des Pellikels auf die relativen Fluoreszenzintensitäten festgestellt werden konnte, traf bei Methode B beides zu. Bei Methode C hatte das Material keinen Einfluss, dafür aber die Pellikelbildung. In den Vorversuchsreihen war Methode B am präzisesten und Methode C besaß eine bessere Reproduzierbarkeit als Methode A. Zudem konnte in den Vorversuchen eine Abhängigkeit der Ergebnisse von der Verwendungsart des Fluoreszenzfarbstoffes festgestellt werden.
Im dritten Teil dieser Arbeit wurde die konventionelle Resazurin-Reduktionsmethode (Methode A) mit der Quantifizierungsmethode mittels Cytox Violet® (Methode C) in einer hydrodynamischen Fließkammer verglichen. Dies geschah jeweils mit und ohne Pellikelbildung aus einer Speichelersatzlösung. Für die Versuche unter dynamischen Bedingungen wurden die Probematerialien Zahnschmelz, Sinfony und Palapress vario ausgewählt. Auch hier wurde aus oben genanntem Grund von jedem Versuch unter dynamischen Bedingungen eine rasterelektronenmikroskopische Aufnahme des Prüfkörpers, mit dem das höchste und niedrigste relative Fluoreszenzsignal erzeugt wurde, mit 1700-facher und 3800-facher Vergrößerung erstellt. Sowohl bei Methode A als auch Methode C konnte ein Einfluss der Materialien auf die relativen Fluoreszenzintensitäten nachgewiesen werden. Bei Methode C war außerdem ein Einfluss der Pellikelbildung auf die relativen Fluoreszenzintensitäten feststellbar. Sowohl bei den Versuchen unter dynamischen Bedingungen als auch bei den semistatischen Versuchsaufbauten wurden sehr unterschiedliche Ergebnisse erzielt. Bei den Hauptversuchen war Methode C ohne vorherige Pellikelbildung genauer als Methode A, bei den Versuchen mit vorheriger Pellikelbildung war es umgekehrt.
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
An important research topic in dentistry is concerned with the adhesion of microorganisms to denture materials. In this context, caries-causing microorganisms (such as streptococcus mutans) are of special interest. An important approach represents the development of restorative materials which ensure a low adhesion of bacteria. This is usually determined in experiments in vitro. For these ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
An important research topic in dentistry is concerned with the adhesion of microorganisms to denture materials. In this context, caries-causing microorganisms (such as streptococcus mutans) are of special interest. An important approach represents the development of restorative materials which ensure a low adhesion of bacteria. This is usually determined in experiments in vitro. For these experiments in vitro efficient and precise quantification methods are of importance. At this, especially an easy and time saving application as well as a small amount of waste products is of interest.
A well accepted method for in vitro experiments is provided by fluorescent dyes which were originally used for investigations of viability such as the quantification of bacteria in cow's milk, but have become accepted as a valuable method for quantification of microorganisms organized in biofilms in microtiter plates. Fluorescent dyes that capture only the living portion of the bacteria population are of particular interest for the quantification of bacteria. Such an advanced dye is Cytox Violet®, the properties of which is to be investigated in this study. In different experimental setups Cytox Violet® was compared to the already established conventional resazurin reduction method, persisted with at the biological laboratory of the Department of Prosthodontics, University of Regensburg. The bacteria Streptococcus mutans was selected because it demonstrated to play an essential role in the development of caries.
In the first part of the investigations the dye concentrations were chosen for three different quantification methods. The first quantification method represents the conventional resazurin reduction method (method A). In this setup, the resazurin is incubated during the simulation of biofilm formation. In the second method of quantification (method B) resazurin was incubated after the adhesion of streptococcus mutans had already taken place. For the third quantification method Cytox Violet® was used (method C), which was also added after the bacterial adhesion. The experiments were carried out with various concentrations of dye with the sample materials, glass, polyethylene and palapress vario. For method A and B a resazurin concentration of 15 µl resazurin per ml of PBS or bacterial solution was chosen and for method C 20 µl Cytox Violet® per 200 µl bacterial solution was chosen.
In the second part of this study the three quantification methods were investigated with the fixed dye concentration with and without pellicle formation in a semi-static test set. The same sample materials as in the first experimental setup were chosen. In this experimental setup a scanning electron micrograph of 1700-fold and 3800-fold magnification of the specimens was created of the sample with the highest and lowest fluorescence signal. This was done to ensure a visual inspection of the bacterial adhesion. Using a computer program, the percentage of the surface covered with bacteria was determined from these images.
The results of the three quantification methods in the second part of this study were very different. Method A had neither an influence on the material, nor on the pellicle. With Method B on the contrary, an influence of both the material and the pellicle was observed. Using method C, the material had no effect on the adhesion of bacteria while the pellicle did. Standard deviation was most precise for method B, method C had better reproducibility than method A. In addition, a dependence of the results on the usage of the fluorescent dye was detected in the preliminary tests. In the third part of this study the conventional resazurin reduction method (method A) was compared to the quantification method using Cytox® Violet (method C) in a hydrodynamic flow chamber. This was done both with and without pellicle formation of a saliva substitute solution. For the experiments under dynamic conditions, the sample materials enamel, Sinfony and palapress vario were selected. Here, too, a scanning electron micrograph of the sample with the highest and lowest relative fluorescence signal was created with 1700-fold and 3800-fold magnification. An influence of the material could be detected on the relative fluorescence intensities using method A and method C. In method C also an influence of pellicle formation on the relative fluorescence intensities was observed. In the experiments under dynamic conditions as well as in the semi-static test setups very different results were obtained. For the experiments under dynamic conditions method C was more accurate than method A without pellicle formation, in the experiments with prior pellicle formation the result was reversed.
Metadaten zuletzt geändert: 26 Nov 2020 01:58