Tools and applications for one- and two-dimensional gas chromatography – time-of-flight mass spectrometry-based metabolomics - Publikationsserver der Universität Regensburg

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Almstetter, Martin F.

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Veröffentlichungsdatum dieses Volltextes: 17 Feb 2012 09:09

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Dokumentenart:	Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation)
Open Access Art:	Primärpublikation
Datum:	17 Februar 2012
Begutachter (Erstgutachter):	Prof. Dr. Frank-Michael Matysik und Prof. Dr. Peter Oefner
Tag der Prüfung:	6 Februar 2012
Institutionen:	Medizin > Institut für Funktionelle Genomik > Lehrstuhl für Funktionelle Genomik (Prof. Oefner) Chemie und Pharmazie > Institut für Analytische Chemie, Chemo- und Biosensorik > Instrumentelle Analytik (Prof. Frank-Michael Matysik)
Stichwörter / Keywords:	Comprehensive two-dimensional gas chromatography electron ionization time-of-flight mass spectrometry (GC×GC-EI-TOFMS), gas chromatography, mass spectrometry, metabolomics, metabolic fingerprinting, data mining, alignment, metabolite profiling, Umfassende 2-dimensionale Gas Chromatographie gekoppelt mit der Flugzeitmassenspektrometrie, Gas Chromatographie, Massenspektrometrie, Metabolomik, Datenauswertung
Dewey-Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik > 540 Chemie
Status:	Veröffentlicht
Begutachtet:	Ja, diese Version wurde begutachtet
An der Universität Regensburg entstanden:	Ja
Dokumenten-ID:	23429

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Zusammenfassung (Englisch)

Zusammenfassung (Englisch)

The study of cellular metabolite profiles and changes therein due to genetic and environmental influences is termed metabolomics. A major, yet to be realized goal is the detection and quantification of all metabolites in a single analysis.
In this work, a comprehensive two-dimensional gas chromatography time-of-flight mass spectrometry (GC×GC-TOFMS) method was designed and validated that assembles the entire available analytical information from each sample in one data matrix for subsequent statistical evaluation. For the purpose of data merging we developed and implemented the retention time correction and data alignment tool INCA (Integrative Normalization and Comparative Alignment). The INCA module capitalized on the characteristic fragmentation behavior of silylated metabolites upon EI ionization by using the integral of the m/z 73 ion trace of the trimethylsilyl (TMS) group as quantitative measure for all features. The method was applied to reveal differences in metabolite composition between (i) an Escherichia coli wild type and a double-mutant strain lacking the transhydrogenases UdhA and PntAB and (ii) serum and plasma. Subsequently, we evaluated the performance of the Statistical Compare alignment function introduced later by LECO for GC×GC-TOFMS data and compared it to INCA.
GC×GC-TOFMS was comprehensively evaluated against various 1D-GC-MS techniques using a set of 43 metabolite standards from different chemical classes and metabolic pathways. GC×GC-TOFMS proved to be the most powerful method with a linear range of more than three orders of magnitude, LLOQs in the sub-micromolar and LODs in the nanomolar range.
GC×GC-TOFMS was also employed for absolute quantification of amino acid enantiomers (AAEs) as their methyl chloroformate derivatives and results were compared to those of a previously established 1D-GC-qMS method with single ion monitoring. The coupling of a gamma-cyclodextrin (Rt-gammaDEXsa) with an amino acid selective (ZB-AAA) column resulted in enhanced peak resolution. Twenty AAEs including the critcal peak pair L-leucine/D-isoleucine, which exhibited equal fragmentation behavior upon EI ionization in 1D-GC-MS, could be baseline separated. Except for methionine enantiomers, distinctly improved LLOQs were obtained. The method was applied to the analysis of AAE serum concentrations in patients suffering from liver cirrhosis and showed significantly increased D-AA concentrations and slightly decreased L-AA levels compared to a control group.

Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)

Die Fachrichtung Metabolomik beschäftigt sich mit der umfassenden Analyse von zellulären Stoffwechselprodukten in Abhängigkeit von genetischen und umweltbedingten Einflüssen. Ein wesentliches Ziel ist die Detektion und Quantifizierung möglichst aller Metabolite in einer einzigen Messung.
In dieser Arbeit wurde auf Basis der komprehensiven zweidimensionalen Gaschromatographie gekoppelt mit der Flugzeitmassenspektrometrie (GC×GC-TOFMS) ein Verfahren zur Extraktion der gesamten zur Verfügung stehenden analytischen Informationen aus einem GC×GC-TOFMS Lauf und der Zusammenführung mehrerer Läufe in einer Datenmatrix zur nachfolgenden statistischen Auswertung des gesamten Datensatzes entwickelt. Zum Zweck der Datenzusammenführung haben wir den INCA (Integrative Normalization and Comparative Alignment) Algorithmus zur Retentionszeit-Korrektur und zum Datenabgleich entwickelt und implementiert. INCA nutzt das charakteristische Fragmentierungsverhalten von silylierten Metaboliten bei vorangehender Elektronen-Ionisierung (EI) und setzt das Integral der m/z 73 Ionenspur der Trimethylsilylgruppe als quantitative Größe für alle Einträge der Peak-Listen ein. Diese vergleichende Metabolic Fingerprinting Strategie wurde verwendet, um globale metabolische Veränderungen zu detektieren. Zum einen wurde mittels GC×GC-TOFMS ein E. coli Wildtypstamm im Vergleich mit der entsprechenden Deletionsmutante UdhA-PntAB untersucht, in der beide Nikotinamidnukleotid-Transhydrogenasen fehlen. Zum anderen wurden Unterschiede zwischen Serum- und Plasma-Proben analysiert. In einem separaten Verfahren wurde die später entwickelte Statistical Compare (SC) Funktion von LECO zur Datenanordnung in die Datenprozessierungs-Strategie mit eingebunden. Diverse Vor- und Nachteile von SC wurden im direkten Vergleich zu INCA ermittelt.
Das Leistungsvermögen der GC×GC-TOFMS im Vergleich zu anderen GC-MS Techniken wurde anhand von 43 Metaboliten von unterschiedlichen chemischen Klassen und metabolischen Stoffwechselwegen evaluiert. GC×GC-TOFMS erwies sich als die leistungsfähigste Methode mit linearen Bereichen von mehr als drei Größenordnungen, unteren Bestimmungsgrenzen im sub-mikromolaren und Nachweisgrenzen im nanomolaren Bereich.
Desweiteren wurde GC×GC-TOFMS zur absoluten Quantifizierung von Aminosäure Enantiomeren als deren Methylchloroformat Derivate angewendet. Die Resultate wurden mit denen einer im Vorfeld etablierten 1D-GC-qMS Methode mit Einzelionen-Nachweis verglichen. Die Kopplung einer gamma-Cyclodextrin (Rt-gammaDEXsa) mit einer Aminosäure-selektiven (ZB-AAA) Säule führte zu einer deutlich verbesserten Auflösung. Zwanzig Aminosäure Enantiomere konnten bis zur Grundlinie voneinander getrennt werden, einschließlich des kritischen Peakpaares L-Leucin/D-Isoleucin, das in der 1D-GC-MS zur gleichen Retentionszeit eluierte und dasselbe Fragmentierungsmuster zeigte. Es wurden, mit Ausnahme der Methionin Enantiomere, im Allgemeinen verbesserte untere Bestimmungsgrenzen erzielt. Die Methode wurde zur Bestimmung der Konzentrationen von Aminosäure Enantiomeren in Serumproben von Leberzirrhose-Patienten angewandt. Im Vergleich zu einer Kontroll-Gruppe wurden erhöhte D- und leicht verminderte L-Aminosäure Konzentrationen festgestellt.

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