Das humane Cytomegalievirus (hCMV) ist ein medizinisch hoch relevantes Herpesvirus, das bei Menschen mit geschwächtem Immunsystem (z.B. AIDS- und Transplantationspatienten) lebensbedrohliche Krankheiten auslösen kann und zudem die wichtigste infektiöse Ursache für embryonale Defekte ist. Bisher steht jedoch kein wirksamer hCMV-Impfstoff zur Verfügung und das Spektrum geeigneter Therapeutika ist ...
Zusammenfassung (Deutsch)
Das humane Cytomegalievirus (hCMV) ist ein medizinisch hoch relevantes Herpesvirus, das bei Menschen mit geschwächtem Immunsystem (z.B. AIDS- und Transplantationspatienten) lebensbedrohliche Krankheiten auslösen kann und zudem die wichtigste infektiöse Ursache für embryonale Defekte ist. Bisher steht jedoch kein wirksamer hCMV-Impfstoff zur Verfügung und das Spektrum geeigneter Therapeutika ist äußerst begrenzt. Das immediate-early 1 Protein (IE1) ist ein viraler Schlüsselregulator, der Proteine und übergeordnete Strukturen des infizierten Wirtszellkerns in vielfältiger Weise manipuliert und in der initialen Phase der Infektion in entscheidender Weise den weiteren Verlauf der hCMV-Replikation und Pathogenese bestimmt. Ein Ziel dieser Arbeit war es, das Potential der RNA-Interferenz-Technologie als neues Therapiekonzept gegen hCMV zu untersuchen. Hierfür wurde ein Luciferase-Reportervirus hergestellt, welches das schnelle Screening antiviraler Effekte ermöglicht. Aus insgesamt 40 getesteten hCMV-gerichteten siRNAs konnten acht Moleküle identifiziert werden, die eine spezifische Inhibition der Virusvermehrung um mehr als 90% bewirkten. Die effektivsten Kandidaten wurden in Richtung einer therapeutischen Nutzung optimiert. In diesem Zusammenhang wurden IE1- und/oder IE2-spezifische siRNAs mit Zielsequenzen, die innerhalb aller annotierten hCMV-Stämme konserviert vorliegen und auch gegen klinisch relevante hCMV-Isolate antiviral aktiv waren, ausgewählt und chemisch modifiziert. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss von IE1 auf das humane Transkriptom untersucht. Dazu wurde mit einem im Rahmen dieser Arbeit etablierten induzierbaren Expressionssystem, welches die Analyse von funktionellem IE1 außerhalb der komplexen Situation einer Virusinfektion ermöglicht, eine systematische Genexpressions-Analyse durchgeführt. Dadurch konnten 25 IE1-induzierbare humane Gene identifiziert werden, die zugleich überwiegend in Zusammenhang mit der zellulären Typ II Interferon (IFN)-Antwort stehen. Mit Hilfe verschiedener Techniken wie der quantitativen reversen Transkriptase-PCR, Immunfluoreszenz-Analysen, zellulären Fraktionierungen, Chromatin-Immunpräzipitationen sowie der Herstellung transgener Zellen, konnte ein zweiphasiger Mechanismus der IE1-vermittelten Genregulation mit Beteiligung löslicher Faktoren ermittelt werden. Des Weiteren wurde gezeigt, dass die IE1-abhängige Induktion der normalerweise durch Typ II IFN regulierten Gene interessanterweise IFN-unabhängig erfolgt. Sie ist aber dennoch abhängig vom aktivierten (Y701-phosphorylierten) signal transducer and activator of transcription 1 (STAT1), einem kritischen zellulären Mediator der IFN-Antwort. In Korrelation dazu konnte eine IE1-vermittelte nukleäre Akkumulation sowie eine spezifische Assoziation des STAT1-Proteins mit den Promotoren Typ II IFN-stimulierter Gene beobachtet werden. Aufgrund der gewonnenen Daten ließ sich schließlich ein vorläufiges Modell für die IE1-induzierte Typ II IFN-artige Antwort entwickeln. Die Ergebnisse dieser Arbeit identifizieren IE1 als vielversprechende neue Zielstruktur für die hCMV-Therapie und offenbaren eine bisher noch unbekannte Funktion des viralen Proteins, die im Zusammenhang mit der hCMV-vermittelten Pathogenese oder der Virusreaktivierung stehen könnte.
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
Human cytomegalovirus (hCMV) is a highly prevalent pathogen that, upon primary infection, establishes life-long persistence in all infected individuals. Acute hCMV infections cause a variety of diseases in humans with developmental or acquired immune deficits. Currently, there is no vaccine that can prevent hCMV infection and disease. Moreover, therapeutic options are restricted to a few small ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
Human cytomegalovirus (hCMV) is a highly prevalent pathogen that, upon primary infection, establishes life-long persistence in all infected individuals. Acute hCMV infections cause a variety of diseases in humans with developmental or acquired immune deficits. Currently, there is no vaccine that can prevent hCMV infection and disease. Moreover, therapeutic options are restricted to a few small molecule inhibitors of the viral DNA polymerase with limited anti-viral efficacy and significant toxic side effects. One aim of this work was to develop RNA interference (RNAi) as an innovative strategy to control hCMV infection. For this approach, a recombinant luciferase indicator virus was constructed which permits fast monitoring of larger numbers of short interfering RNAs (siRNAs) for antiviral effects. Out of the 40 candidate anti-hCMV siRNAs tested, eight duplexes inhibited viral replication by more than 90%. The siRNAs targeting the viral IE1 and IE2 transcripts turned out to be the most promising ones and were therefore optimized towards in vivo applications. In the second part of this work, the effects of the hCMV IE1 protein on the human transcriptome were systematically analyzed. The immediate-early 1 protein (IE1) is a viral key regulator which manipulates proteins and supra-molecular structures of the infected host cell nucleus in many different ways. Furthermore, IE1 is the first and most abundantly expressed viral gene product in the immediate-early stage of infection and critically determines the initiation and outcome of hCMV infection. Following expression under conditions closely mimicking the situation during productive infection, IE1 elicited a global type II interferon (IFN)-like host cell response. This response was dominated by the selective up-regulation of immune stimulatory genes normally controlled by IFN-γ. Using a range of techniques including quantitative reverse transcriptase PCR, immunofluorescence microscopy, subcellular fractionation, chromatin immunoprecipitation and construction of transgenic cells, a two-step mechanism involving soluble factors was found to underlie the IE1-dependent gene activation. Interestingly, however, neither synthesis nor secretion of IFN-γ or other IFNs seemed to be required for the IE1-dependent effects. Nonetheless, IE1-mediated induction of IFN-stimulated genes strictly depended on tyrosine-phosphorylated signal transducer and activator of transcription 1 (STAT1) and correlated with the nuclear accumulation and sequence-specific binding of STAT1 to IFN-γ-responsive promoters. The findings from this work identify IE1 as a promising new target for prevention or therapy of hCMV infection and indicate that a single hCMV protein can trigger a robust pro-inflammatory immune response via a unique molecular mechanism. We propose that the newly identified IE1 response has implications for hCMV dissemination, virus reactivation from latency and/or viral pathogenesis.
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