Background Sphingolipids which form part of the cellular plasma membrane serve as key metabolites in metabolic processes and play a decisive role in cellular activities such as migration and apoptosis. The enzyme ceramidase hydrolyses ceramide to sphingosine and free fatty acid. Ceramidase occupies a central role in ceramide metabolism, and its substrate, ceramide, is a bioactive lipid involved in cellular homoeostasis and the regulation of signaling pathways. The isoform of neutral ceramidase (NC) has yet to be elucidated, and currently there are no reports regarding this isoform activity in human blood plasma. We aimed to establish an optimized assay for the determination of human NC in plasma to characterize its activity in a group of healthy controls. Previous research has demonstrated ethanol-induced activation of sphinomyelinase, which catalyses sphingosine to ceramide. We endeavored to determine if ethanol induces activity of plasmatic NC. We then analyzed the activity of plasmatic NC in a group of alcohol dependent patients during alcohol withdrawal to determine whether alcohol consumption causes a change in NC activity and whether there is a relation between plasmatic NC and pathophysiological processes in alcohol dependence. Methods The activity of ceramidase was determined by hydrolysis of a fluorescently labeled NBD-C12-ceramide to sphingosine and NBD-labeled fatty acid which was quantified after lipid extraction and separation from the uncleaved substrate by thin layer chromatography. After characterization of the enzyme’s properties and optimization of its reaction conditions the activity of plasmatic NC was measured in 156 (GENES-study) and 36 (ASPECT-study) healthy probands. The correlation of plasmatic activity with routine blood parameters, lifestyle factors, psychometric and brain-morphological criteria of the study participants was analyzed. The NC activity during alcohol withdrawal as well as its relation with different alcohol and blood parameters were examined in a third study group (ALC-study, n = 27) of alcohol dependent patients. Results Whereas previous studies dealt with NC limited to cells and tissues, we have detected NC activity in human blood plasma for the first time. In both studies, GENES and ASPECT, there was a highly significant difference of plasmatic NC activity between male and female probands. The level of NC activity in females was twice as high as that in males. The weekly profile of NC activity also showed gender-specific results. Compared to nearly constant levels in males, the NC activity in females varied strongly from day to day. The correlation analysis of plasmatic NC with different blood parameters revealed significant gender-related associations with typical cardiovascular risk factors, for example with homocysteine and parameters of lipid metabolism (cholesterol, triglycerides, HDL, LDL). In contrast to the acid sphingomyelinase, the NC activity of alcohol dependent patients did not change consistently during withdrawal. Conclusions The enzyme ceramidase is present in human blood plasma at detectable levels with considerable activity variation in females which could be due to gender-specific regulation of this enzyme. The exact ceramidase regulatory mechanisms, however, remain unknown and further studies are necessary to explore detailed sphingolipid interactions and possible determining factors. The investigation of female probands in the course of a month might reveal a menstruation dependent regulation and hormonal changes of NC activity. The significant correlation of NC activity with blood parameters, particularly with cardiovascular risk factors, could be associated with pathological processes. Due to the ease of sampling blood in patients, the NC activity could possibly serve as a new diagnostic biomarker in the clinical setting. The pathophysiological connections in lipid metabolism are multitudinous and further investigations are required to elucidate the role of ceramidase and its interactions in sphingolipid metabolism.

Hintergrund und Ziele Die zu den Membranmolekülen gehörenden Sphingolipide fungieren als Schlüsselmetabolite bei Stoffwechselprozessen und spielen eine wichtige Rolle bei zellulären Vorgängen wie Migration und Apoptose. Die Ceramidase, die die Hydrolyse des Sphingolipids Ceramid zu Sphingosin und freier Fettsäure katalysiert, nimmt dabei eine zentrale Stellung ein, indem sie über das antiproliferativ wirkende Ceramid die zelluläre Homöostase und Signaltransduktionsprozesse reguliert. Über die Isoform der neutralen Ceramidase (NC) ist bislang nur wenig bekannt und über deren Enzymaktivität im menschlichen Blutplasma war bisher noch nicht berichtet worden. Ziel der Arbeit war die Etablierung eines Assays zur optimalen Enzymaktivitätsbestimmung der humanen Ceramidase im Plasma, um anschließend deren Aktivität in einem Kollektiv gesunder Probanden zu charakterisieren. Da eine Ethanol-induzierte Aktivierung der Sphingomyelinase, die Sphingomyelin zu Ceramid umwandelt, im Blutplasma nachgewiesen worden war, sollte die Analyse der plasmatischen NC in einem weiteren Kollektiv von alkoholabhängigen Probanden im Verlauf des Entzugs zeigen, ob sich die NC-Aktivität unter Alkoholkonsum ebenfalls verändert und damit ein Zusammenhang der plasmatischen NC mit pathophysiologischen Prozessen bei Alkoholabhängigkeit besteht. Methoden Die Enzymaktivitätsbestimmung der Ceramidase erfolgte anhand der Hydrolyse von fluoreszenz-gekoppeltem NBD-C12-Ceramid in Sphingosin und NBD-C12-Fettsäure, die nach Lipidextraktion mittels Dünnschichtchromatographie vom Substrat separiert und (nachfolgend) quantifiziert wurde. Nach Optimierung der Reaktionsbedingungen wurde die Ceramidase in zwei Studienkollektiven von 156 (GENES-Studie) und 36 (ASPECT-Studie) gesunden Probanden bestimmt und ihre Korrelation mit Blutparametern, Lebensstilfaktoren sowie psychometrischen und hirnmorphologischen Daten der Studienteilnehmer analysiert. Im Rahmen der ALC-Studie wurden anschließend die NC-Aktivität bei 27 alkoholabhängigen Patienten im Verlauf des stationären Entzugs und ihr Zusammenhang mit bestimmten Alkohol- und Blutparametern untersucht. Ergebnisse und Beobachtungen Während bisher eine Aktivität nur in Zellen und Gewebe detektiert worden war, ist uns erstmalig der deutliche Nachweis der Ceramidase im menschlichen Plasma gelungen. Bei gesunden Probanden der GENES- und ASPECT-Studie konnte ein hochsignifikanter Unterschied der plasmatischen Ceramidase-Aktivität zwischen männlichen und weiblichen Studienteilnehmern festgestellt werden: Frauen hatten durchschnittlich mehr als doppelt so hohe Aktivitätswerte wie Männer. Die Analyse im Wochenverlauf ergab ebenso geschlechtsspezifische Ergebnisse: während die plasmatische NC-Aktivität bei Frauen interessanterweise innerhalb von Tagen schwankte, änderten sich die Aktivitätswerte männlicher Probanden kaum. Die Korrelationsanalyse der plasmatischen Ceramidase mit Blutparametern lieferte ebenfalls geschlechtsabhängige, signifikante Zusammenhänge mit typischen kardiovaskulären Risikofaktoren, wie Homocystein und Parametern des Fettstoffwechsels [Cholesterin, Triglyceride, HDL (engl. high density lipoprotein), LDL (engl. low density lipoprotein)]. Bei alkoholkranken Patienten (ALC-Studie) bestanden im Gegensatz zur Sphingomyelinase keine einheitlichen Veränderungen der Ceramidase-Aktivität im Verlauf des Entzugs. Praktische Schlussfolgerungen Die erstmalig im menschlichen Blutplasma nachgewiesene Ceramidase-Aktivität scheint einer geschlechtsspezifischen Regulation zu unterliegen. Die Zusammenhänge sind bisher noch weitgehend ungeklärt und in weiteren Studien gilt es, potentielle Einflussgrößen und die genauen Wechselwirkungen des Sphingolipidstoffwechsels genauer zu explorieren. So wäre es interessant, weibliche Probanden im Monatsverlauf zu untersuchen, um einen zyklusabhängigen Verlauf und damit eine mögliche hormonelle Regulation der NC aufzuzeigen. Die festgestellte signifikante Korrelation der NC mit bestimmten Blutparametern, insbesondere mit kardiovaskulären Risikofaktoren, könnte hinweisend für gewisse pathologische Zusammenhänge sein. In diesem Kontext könnte die plasmatische Ceramidase einen neuen Biomarker darstellen, der sich, u.a. wegen der leichten Zugänglichkeit von Blut im klinischen Alltag, zur Analyse pathophysiologischer Prozesse sowie der Beurteilung des Therapieverlaufs eignen könnte.