For more than 100 years, the microscopic analysis of Giemsa-stained peripheral blood smears has been the gold standard for the routine diagnosis of hematological disorders. To accurately interpret peripheral blood smears, well-stained samples and time consuming microscopic analyses are required, which still show high inter-observer variation. Automated hematology analyzers provide a complete blood count and leukocyte differential, but only flag atypical results as “abnormal”, which provides no clear classification due to method limitations. To overcome the analytical limitations of today’s methods, the analysis of native blood cells in suspension would be highly attractive for routine clinical diagnosis. Digital holographic microscopy (DHM) was suggested as method of choice for label-free cell imaging, because the phase contrast provides rich intracellular information due to subtle refractive index changes at internal structures. In this thesis, a flow cytometry-based method for the label-free analysis of unprocessed blood cells by DHM, using highly controlled two-dimensional focusing conditions, is reported. The combination of a 50 x 500 µm PMMA microfluidics channel for precise microfluidics focusing of the cells with a customized differential DHM, allowed high-throughput imaging without the need for time-consuming autofocusing procedures. Hereby, a label-free nine-part differential of untouched leukocytes was achieved by principal component analysis of morphological characteristics of the reconstructed images. In addition, a classification strategy for the differentiation of acute myeloid leukemia, acute lymphocytic leukemia, chronic lymphocytic leukemia and various myeloproliferative neoplasms was established. The results suggest the possibility for monitoring of leukemia progression by demonstrating the disappearance of acute myeloid leukemia cells in remission. To exclude confounding effects, the classification strategy was tested by the analysis of 20 blinded clinical samples. Here, 70 % of the specimens were correctly classified with further 20 % classifications close to a correct diagnosis, which verified the discrimination strategy. Apart from a detection and classification of hematological disorders, the developed label-free method was also used for the diagnosis of malaria-infected samples. Effective malaria treatment requires rapid and accurate diagnosis of infecting species and actual parasitemia. Despite the recent success of rapid tests, the analysis of thick and thin blood smears remains the gold standard for routine malaria diagnosis in endemic areas. For non-endemic regions, sample preparation and analysis of blood smears are an issue due to low microscopy expertise, and few cases of imported malaria. For that reason, automation of microscopy results with minimal sample preparation could be beneficial to quickly confirm suspected infections in such conditions. In this study, a label-free detection of P. falciparum infection in sphered erythrocytes, with a parasitemia detection limit of 0.01%, was achieved with the high-throughput DHM based approach. Moreover, the differentiation of P. falciparum ring-, trophozoite- and schizont life cycle stages in synchronized cultures demonstrated the potential for future discrimination of even malaria species and hence, an application in routine malaria diagnostics. Taken together, the findings indicate a broad clinical applicability of the presented imaging cytometry method for automated and reagent‐free diagnosis of hematological disorders and parasitic infections.

Seit mehr als hundert Jahren stellt die mikroskopische Analyse von panchromatisch gefärbten Blutausstrichen die Standardmethode für die Routinediagnostik von hämatologischen Anomalien dar. Für die exakte Analyse und Interpretation von Blutausstrichen ist, neben einer akkuraten Probenpräparation, eine zeitaufwendige, manuelle mikroskopische Analyse notwendig, die jedoch eine hohe Variabilität zwischen verschiedenen Anwendern aufweist. Automatisierte Hämatologie-Analysatoren liefern zwar ein vollständiges Differentialblutbild inklusive einer Differenzierung der Leukozyten, jedoch werden Ergebnisse die von der Norm abweichen lediglich als „abnormal“ gekennzeichnet, wodurch keine klare Klassifizierung gegeben ist. Gründe dafür sind unter anderem die aufwendige Probenvorbereitung, sowie Limitierungen der verwendeten physikalischen Messmethoden. Aus diesem Grund ist die Analyse von nativen Blutzellen in Lösung als eine signifikante Verbesserung für die klinische Routinediagnostik anzusehen, da dadurch potentiell ein Mehrwert an Information erhalten bleibt. Digital holographische Mikroskopie (DHM) ist dabei als präferentielle Methode anzusehen, da bereits kleine Unterschiede im Brechungsindex von Zellen zu einer Phasenänderung führen, die Rückschlüsse über die intrazelluläre Zusammensetzung erlauben. In dieser Arbeit wurde erfolgreich eine Methode zur markierungsfreien Analyse von Zellen mittels DHM im Hochdurchsatz entwickelt. Dabei wurde zur hochpräzisen, zwei-dimensionalen Führung und Fokussierung der Zellen ein mikrofluidisches System verwendet, dass in Kombination mit einem speziell angepassten differentialen DHM eine Hochdurchsatzaufnahme von Zellen erlaubt, ohne dabei auf zeit- und rechenaufwendige Autofokussierungstechniken zurückgreifen zu müssen. Mit diesem System konnte mittels Hauptkomponentenanalyse von morphologischen Parametern, die aus den rekonstruierten Phasenbildern berechnet wurden, eine Differenzierung von neun unterschiedlichen Leukozyten Arten erreicht werden. Des Weiteren wurde eine Unterscheidung von akuter myeloischer Leukämie, akuter lymphatischer Leukämie, chronischer lymphatischer Leukämie und verschiedener myeloproliferativen Neoplasien erreicht. Da in einer Probe auch der Rückgang von malignen Zellen bei vollständiger Remission von akuter myeloischer Leukämie gezeigt werden konnte, liegt eine Anwendung der Methode zur Verlaufskontrolle nahe. Zur Verifizierung der Klassifizierungsstrategie wurden 20 verblindete klinische Proben analysiert, wobei bei 70 % der Proben eine übereinstimmende Diagnose und bei weiteren 20 % eine annähernd korrekte Diagnose erzielt wurde. Durch dieses Ergebnis wurde die Integrität der Methode zur Klassifizierung von verschiedenen Leukämien bestätigt. Neben der Verwendung in der Standard-Hämatologie wurde ebenso der Einsatz der neu entwickelten Methode für die Malariadiagnostik untersucht. Für eine effektive Behandlung von Malaria Infektionen ist eine schnelle und korrekte Diagnose der infizierenden Spezies und Parasitämie entscheidend. Dabei sind die Analyse von gefärbten Blutausstrichen und der Dicke Tropfen immer noch die Standardmethoden in den betroffenen Regionen. Zwar haben Malaria-Schnelltests in den letzten Jahren an Bedeutung gewonnen, allerdings ist mit diesen Tests eine Parasitämie Bestimmung nicht möglich. In westlichen Ländern ist die Diagnose von Malaria aufgrund der geringen Anzahl der vorkommenden Fälle und der damit verbundenen geringen Expertise in der Analyse der Proben, problematisch. Ein mikroskopisches System mit automatisierter Probenaufnahme und -analyse würde deshalb eine wesentliche Erleichterung zur schnellen Bestätigung von Verdachtsfällen darstellen. In dieser Arbeit wurde eine markierungsfreie Detektion von P. falciparum infizierten Erythrozyten mit einer Sensitivität von 0.01 % infizierter Zellen erreicht. Zusammen mit der zusätzlich erreichten Unterscheidung von Ring- Trophozoit- und Schizontstadien in synchronisierten Kulturen, ist auch eine Unterscheidung von verschiedenen Malaria Spezies möglich. Eine zukünftige Anwendung in der Routinediagnostik von Malaria Fällen ist damit denkbar. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit die Möglichkeit einer breiten, klinischen Anwendung des entwickelten, auf DHM basierten Hochdurchsatzsystems, für eine automatisierte Diagnose von hämatologischen Anomalien und parasitären Erkrankungen, ohne vorherige aufwendige Probenvorbereitung.