Glutamate is the main excitatory neurotransmitter in the mammalian central nervous system. The specific roles of various glutamatergic subpopulations, however, have remained elusive. This is in part due to the difficulty of identifying them in live brain or spinal cord slices, where the neuronal subtypes are not readily distinguishable. Another critical point was to define a specific marker for glutamatergic neurons. Glutamate (being a general metabolic precursor), glutaminase and plasma membrane glutamate transporters are not suitable for this purpose as they have been also detected in non-glutamatergic neurons. Three isoforms of vesicular glutamate transporters (VGLUT1, VGLUT2, VGLUT3) with complementary distribution throughout the CNS have been recently cloned and are considered to represent the most specific markers so far for glutamatergic neurons. The regional distribution of the three VGLUT isoforms has been studied in detail in the rat CNS. This study examined the distribution of the VGLUT2 immunoreactivity in the CNS of the adult mouse. Results showed that the VGLUT2 protein was most intense in the spinal cord, thalamus and hypothalamus (diencephalon) and brain stem. Certain layers of the cortex, cerebellum and hippocampus showed dense VGLUT2 innervation. VGLUT2 puncta were enriched in pain processing areas of the spinal cord, the thalamocortical pathway and the periaqueductal gray (PAG). In order to provide a useful tool for the characterization of glutamatergic pathways, an attempt was made to generate BAC (Bacterial Artificial Chromosome) transgenic mice expressing red fluorescent protein (DsRed2) under the transcriptional control of the VGLUT2 gene 17 amino acids upstream of the translational start of VGLUT2. DsRed2 coding cDNA was precisely integrated inframe into exon 2 of the VGLUT2 gene in a BAC clone by two consecutive rounds of homologous recombination (Yang et al., 1997). Under the control of the human cytomegalovirus (CMV) promoter, proper transcription of the construct, splicing of the transcript and the fluorescence of the resulting protein were obtained in transfected HEK-293 cells and SH-SY5Y neuroblastoma cells. Following pronuclear injection of CsCl gradient purified BAC DNA in 505 oocytes, 109 ainmals were born and 10 transgenic founders could be identified. All the founders exhibited germline transmission and gave rise to independent lines with varying copy numbers. The expression of the VGLUT2-DsRed2 construct was analyzed in live and fixed brain and spinal cord slices of the transgenic offspring. Surprisingly, no fluorescence could be detected in the expected regions where VGLUT2 immunoreactivity was defined in this study. A weak fluorescence could be detected in the ganglion nodosum, where the presence of VGLUT2 was reported by Tong et al. (2001). The reasons for this are not clear. Some suggestions for these unexpected phenomena could be that the DsRed2 RNA or protein might be less stable than the products of the replaced VGLUT2 gene. The N-terminal overhang (acting as a targeting sequence) might have participated in protein-protein interactions with other endogenous proteins or other proximity-related phenomena in-vivo. Furthermore this might have led to irreversible binding affecting the tetramer formation necessary for the chromophore maturation of DsRed2. Similar problems have arisen in other groups, who have used DsRed2 as an in-vivo marker. To solve this, Campbell et al. (2002) developed the first true monomeric red fluorescent protein and further attempts were performed by Shaner et al., 2004 to introduce more reliable red shifted markers. A further step in this project would be the generation of BAC transgenic mice in which the VGLUT2 gene is replaced with one of the monomeric forms of the red shifted proteins or the EGFP, which proved to be a reliable marker in transgenic studies. Such a transgenic mouse will be useful in detailed investigation of the anatomical, physiological and molecular analysis of subpopulations of glutamatergic neurons, thus provide important tools for the anatomical and functional characterization of glutamatergic pathways.

Glutamat ist der wichtigste exzitatorische Neurotransmitter im ZNS von Säugern. Die spezifische Rolle verschiedener Subpopulationen von glutamatergen Neuronen ist bisher jedoch unklar. Dies liegt zum Teil an der Schwierigkeit, diese Neuronen im lebenden Gehirn oder Rückenmark zu identifizieren sowie am Fehlen eines spezifischen Markers für glutamaterge Neuronen. Glutamat, Glutaminase und der Plasmamembran Glutamattransporter sind nicht geeignet, da sie nahezu ubiquitär im ZNS vorkommen. Vor kurzem wurden drei Isoformen des vesikulären Glutamattransporters (VGLUT1, VGLUT2 und VGLUT3) mit komplementärer Verteilung im ZNS kloniert. Diese gelten als weitgehend spezifische Marker für glutamaterge Neuronen. In der vorliegenden Arbeit wurde die Verteilung der Immunreaktivität von VGLUT2 im ZNS der Maus untersucht. VGLUT2 kommt demnach am häufigsten im Rückenmark, Thalamus, Hypothalamus (Dienzephalon) und Hirnstamm vor. Bestimmte Schichten im Kortex, Kleinhirn und Hippokampus zeigen ebenfalls stark positive Färbungen für VGLUT2. Intensive VGLUT2-Signale ließen sich in schmerzmodulierenden Regionen im Rückenmark, in den thalamo-kortikalen Bahnen und dem periaqueduktalen Grau nachweisen. Um eine detailierte Analyse VGLUT2-positiver glutamaterger Neuronen und deren Verschaltung zu ermöglichen, wurden BAC (Bacterial Artificial Chromosome) transgene Mäuse generiert, die ein rot fluoreszierendes Protein (DsRed2) unter der transkriptionellen Kontrolle des VGLUT2-Gens exprimieren sollten. In zwei aufeinander folgenden Schritten homologer Rekombination (Yang et al., 1997) wurde in ein VGLUT2 enthaltendes BAC die DsRed2-kodierende Sequenz in Exon 2 des VGLUT2-Gens kloniert. Da das DsRed2 dieses Konstrukts N-terminal um 17 Aminosäuren verlängert war und zu dem das Intron 1 erhalten blieb, wurde die ordnungsgemäße Prozessierung dieses Konstrukts zunächst in-vitro überprüft. Dazu wurde das modifizierte DsRed2 unter der Kontrolle CMV Promotors in 293-HEK Zellen exprimiert. Diese transfezierten Zellen zeigten eine deutliche rote Fluoreszenz, was ein ordnungsgemäßes Splicing sowie eine ausreichende Fluoreszenz des N-terminal verlängerten DsRed2 bestätigte. Nach der Injektion des durch CsCl-Gradient-gereinigten Transgens in den Pronukleus von 505 Oozyten wurden 109 Tiere geboren. Unter diesen konnten 10 transgene Founder identifiziert werden, die alle das Transgen vererbten, sich jedoch in der Zahl der ins Genom integrierten Kopien des Transgens unterschieden. Die Expression des VGLUT2-DsRed2-Konstrukts wurde an lebendem und an fixiertem Gewebe von Rückenmark und Gehirn der transgenen Nachkommen analysiert. Überraschenderweise konnte keine Fluoreszenz in den erwarteten Regionen nachgewiesen werden. Eine schwache Fluoreszenz fand sich im Ganglion nodosum, wo VGLUT2 von Tong et al. (2001) beschrieben wurde. Die Gründe dafür sind unklar. Eine mögliche Erklärung für dieses unerwartete Phänomen könnte die niedrigere Stabilität der RNA oder des Proteins DsRed2 sein. Die Verlängerung des N-Terminus des VGLUT2 könnte zu unbeabsichtigten Interaktionen führen. Solche Interaktionen könnten die für die Reifung des DsRed2-Chromophors erforderliche Tetramerisierung negativ beeinflusst haben. Auch in anderen Studien, die DsRed2 als Transgen verwendet haben, hat sich dieses als problematisch erwiesen. Um diese Problematik zu lösen, hat Campbell et al. (2002) das erste echte monomere rot fluoreszierende Protein (RFP) entwickelt. Weitere Versuche wurden von Shaner et al. (2004) durchgeführt, um weitere zuverlässigere rot fluoreszierende Proteine zu entwickeln. Ein weiterer Schritt in diesem Projekt wäre somit die Generierung BAC-transgener Mäuse, in denen das VGLUT2-Gen gegen eines der neuen RFP (Shaner et al., 2004) oder EGFP (der sich als zuverlässiger Marker in Transgenstudien erwies) ersetzt wäre. Eine derartige transgene Maus kann für die detailierte anatomische, physiologische und molekulare Analyse von Subpopulationen glutamaterger Neuronen nützlich sein und somit ein wichtiges Mittel für die anatomische und funktionelle Chatakterisierung glutamaterger Bahnen darstellen.