The following presents two approaches that use combined quantum mechanical/molecular mechanical (QM/MM) methods in order to gain deeper insights into the structure and function of protein-ligand complexes and to understand complex results of protein spectroscopy by extensive computer simulations. In the first part, a combined QM/MM docking approach for investigating protein-inhibitor complexes is presented. Starting points for QM/MM optimizations are generated with AutoDock. The subsequent semiempirical AM1 QM/MM optimization of the complex obtained by the docking procedure gives a more detailed description of the binding mode and the electronic properties of the ligand. As a flexible protein environment is used in the QM/MM optimizations, the method is able to simulate limited structural changes of the enzyme upon binding a ligand, even within a simple geometry optimization. The method was validated using a set of structurally known protein-inhibitor complexes, whose crystallographic data were taken from the Protein Data Bank. In addition to protein structures taken directly from complexes with the inhibitors, structures of uncomplexed HIV-1-protease and thrombin were also used successfully for QM/MM docking experiments. By comparing the resulting structures with those obtained using protein structures from protein-inhibitor complexes, it is shown that the method is able to simulate the effect of the induced fit when a simple optimization is adequate to reproduce the protein movement. Describing the ligand quantum mechanically gives a detailed view of its electronic properties, e.g. its polarization within the active site of the enzyme. This study suggests strongly that a QM/MM molecular dynamics approach will be able to simulate the induced fit in general cases. A computational model study designed to simulate the results of time-resolved fluorescence spectra of tryptophan in proteins is presented in the second part. In such measurements, the occurrence of more than one fluorescence lifetime is generally attributed to the existence of several tryptophan rotamers and/or structural conformations of the protein structure. The system chosen for this initial study is the tetracycline repressor (TetR) protein, an interesting model system for the investigation of the mechanisms of transcriptional regulation. Fluorescence resonance energy transfer (FRET) from tryptophan to tetracycline is frequently observed in complexes of the Tet-repressor with the antibiotic tetracycline. A combined classical/quantum mechanical approach is used to model the structure and the spectroscopic properties of the TetR-tetracycline complex. A classical molecular dynamics simulation provides input geometries for semiempirical QM/MM CI calculations, which are used to calculate tryptophan absorption and fluorescence spectra as well as fluorescence resonance energy transfer (FRET) rate constants. It is shown how a biexponential tryptophan fluorescence decay can be obtained from a molecular dynamics (MD) trajectory containing two tryptophan rotamers by calculating the FRET rate constant for every MD snapshot. The results indicate that the classical rotamer model, used to explain the multiexponentiality of time-resolved tryptophan emission spectra, can be extended to systems with FRET acceptors present in the protein matrix.

In dieser Arbeit werden zwei neue Ansätze aus der Computerchemie vorgestellt, in denen gemischt quantenmechanische/molekülmechanische (QM/MM) Verfahren verwendet werden, um tiefere Einblicke in die Struktur und die Funktion von Protein-Ligand-Komplexen zu erhalten. Außerdem wird gezeigt, wie umfangreiche Computersimulationen zur Erklärung komplexer Befunde aus der Proteinspektroskopie verwendet werden können. Im ersten Teil der Arbeit wird ein kombinierter QM/MM-Docking-Ansatz vorgestellt, mit dem Protein-Inhibitor-Komplexe untersucht werden. Mit Hilfe des Docking-Programms AutoDock wird die Bindung kleiner organischer Moleküle in der Bindetasche von Enzymen vorhergesagt. Hierbei wird der Ligand als flexibles Molekül behandelt, das Protein ist jedoch starr und es kann keine konformative Anpassung des Proteins (induced fit) als Reaktion auf die Ligandbindung erfolgen. Die durch das Docking erhaltenen Strukturen werden mit semiempirischen AM1 QM/MM-Optimierungen verfeinert. Hierbei wird eine verbesserte Beschreibung des Bindungsmodus des Liganden erhalten. Außerdem liefert die quantenmechanische Rechnung eine korrekte Beschreibung der elektronischen Eigenschaften des Liganden. Durch die Verwendung einer flexiblen Proteinumgebung bei den QM/MM-Rechnungen können strukturelle Anpassungen des Enzyms als Reaktion auf die Ligandbindung (induced fit) sogar im Rahmen einer einfachen Geometrieoptimierung simuliert werden, und auf den Einsatz teuerer Methoden (z.B. Moleküldynamik) kann verzichtet werden. Die Methode wurde mit einem Satz durch Röntgenkristallographie aufgeklärter Protein-Inhibitor-Komplexe validiert, deren Geometrien aus der Proteindatenbank (PDB) entnommen wurden. Hierbei wurden auch Metalloproteine, für die das Dockingprogramm keine Parameter hat, erfolgreich gedockt. Hierzu wurden die Standard-Kraftfeldparameter um geeignete Metallparameter ergänzt. Zusätzlich zu den Strukturen von zusammen mit dem Inhibitor kristallisierten Proteinen wurden auch ligandfrei kristallisierte Strukturen von HIV-1-Protease und Thrombin erfolgreich für Docking-Experimente verwendet. Durch den Vergleich der erhaltenen Strukturen mit den Ergebnissen, die unter Verwendung von mit einem Liganden kristallisierten Proteinstrukturen erhalten wurden, konnte gezeigt werden, daß die Methode begrenzte konformative Anpassungen eines Enzyms nach Bindung eines Liganden auch durch einfache Geometrieoptimierungen simulieren kann und in diesen Fällen auf teurere, rechenzeitintensivere Verfahren verzichtet werden kann. Die quantenmechanische Beschreibung des Liganden liefert ein detailliertes Bild seiner elektronischen Eigenschaften, z. B. seiner Polarisation durch die Gruppen im aktiven Zentrum eines Enzyms. Die Ergebnisse der vorgestellten Arbeit weisen darauf hin, daß ein QM/MM-Moleküldynamik-Ansatz den Effekt des induced fit auch in solchen Fällen simulieren kann, in denen größere konformative Anpassungen des Enzyms, wie z. B. das Öffnen einer Bindetasche, erforderlich sind. Im zweiten Teil der Arbeit wird eine Studie vorgestellt, mit Hilfe derer die Ergebnisse zeitaufgelöster Fluoreszenzspektroskopie der Aminosäure Tryptophan in Proteinen erklärt werden können. Bei derartigen Messungen wird häufig mehr als eine Lebensdauer beobachtet, was gewöhnlich mit der Existenz mehrerer Seitenkettenkonformationen von Tryptophan oder mehrerer Proteinkonformationen erklärt wird (Rotamerenmodell). In dieser Arbeit wird das aus zwei Monomeren bestehende Tet-Repressor (TetR)-Protein untersucht, welches ein interessantes Modellsystem für die Erforschung der Mechanismen der transkriptionellen Regulation darstellt. In Komplexen des Tet-Repressors mit Tetracyclin wird häufig Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (Förster-Energie-Transfer, FRET) von der Aminosäure Tryptophan zum Induktor Tetracyclin beobachtet. Die Struktur und Dynamik sowie die spektroskopischen Eigenschaften des TetR-Tetracyclin-Komplexes werden mit Hilfe eines gemischt klassischen/quantenmechanischen Verfahrens untersucht. Eine klassische Moleküldynamik (MD)-Simulation liefert die Eingabegeometrien für semiempirische QM/MM CI-Rechnungen, die verwendet werden, um die zur Simulation der spektroskopischen Eigenschaften der relevanten Chromophore (Tryptophan und Tetracyclin) erforderlichen Größen zu berechnen. Die Analyse der klassischen MD-Simulationen ergab für den Chromophor Tryptophan 43, einer in den DNA-Bindeköpfen der beiden Monomere des TetR-Proteins vorkommenden Aminosäure, zwei (Monomer 1) bzw. fünf (Monomer 2) Rotamere. Zusätzlich zu den Änderungen der Seitenkettenwinkel, die die Rotamere ineinander überführen, wurde eine schnelle Bewegung der Tryptophan-Seitenkette beobachtet. Für die weitere Analyse wurde das Monomer 1, das zwei Rotamere in der MD aufweist, verwendet. Die vorgestellte Methode ist im Gegensatz zu den meisten experimentellen Verfahren in der Lage, die Rotamere unabhängig voneinander zu untersuchen. Neben den stationären Absorptions- und Fluoreszenzspektren von Tryptophan und Tetracyclin wurden auch zeitaufgelöste Fluoreszenzspektren von Tryptophan simuliert. Hierbei wurden zum einen intrinsische (ohne Löschung) Fluoreszenzabklingkurven von Tryptophan aus den Einstein-Koeffizienten, die für jeden MD-Snapshot errechnet wurden, generiert. Die Simulationen zeigen sowohl für die gesamte MD-Trajektorie (2 Rotamere) als auch für die einzelnen Rotamere ein biexponentielles Abklingverhalten. Dieses wird durch die schnelle Bewegung der Tryptophan-Seitenkette, die im Laufe der Simulation zu einer Vielfalt von Tryptophan-Mikroumgebungen führt, verursacht. Zusätzlich zur intrinsischen Fluoreszenz von Tryptophan 43 wurde auch dessen Fluoreszenzlöschung durch Förster-Energietransfer (FRET) zum Induktor Tetracyclin untersucht. Hierzu wurde für jeden MD-Snapshot die Geschwindigkeitskonstante für den Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) berechnet. Es konnte gezeigt werden, daß sowohl die gesamte MD-Trajektorie (2 Rotamere) als auch die einzelnen Rotamere ein biexponentielles Abklingverhalten, verursacht durch FRET, aufweisen. Die schnellen Bewegungen der Tryptophan-Seitenkettenwinkel führen auch hier zu einer Vielfalt an relativen Donor-/Akzeptorgeometrien, was aufgrund der großen Empfindlichkeit von FRET für derartige Geometrieänderungen das biexponentielle Verhalten verursacht. Die Analyse der relativen FRET-Geschwindigkeitskonstanten zeigt, daß die beiden Rotamere eine unterschiedliche Wahrscheinlichkeit für eine Löschung durch Energietransfer aufweisen. Entsprechend werden für die beiden Rotamere unterschiedliche Lebensdauern gefunden. Diese Ergebnisse zeigen, daß das klassische Rotamerenmodell, welches gewöhnlich zur Interpretation zeitaufgelöster Emissionsspektren von Tryptophan dient, die tatsächlichen Verhältnisse zu stark vereinfacht, indem es annimmt, daß jedes Rotamer einer diskreten Lebensdauer zuzuordnen ist. Die vorgestellten Ergebnisse zeigen, daß das biexponentielle Abklingverhalten zumindest im Fall des untersuchten TetR/Tetracyclin-Systems aus den schnellen Bewegungen des Tryptophan-Chromophors und den resultierenden mannigfaltigen Donor-/Akzeptorgeometrien folgt. Die unterschiedlichen FRET-Geschwindigkeitskonstanten/Lebensdauern der Rotamere zeigen aber, daß das Rotamerenmodell für Systeme mit FRET-Akzeptoren erweitert werden kann.