Zelluläre Rezeptoren des Kaposi-Sarkomassoziierten Herpesvirus

Language
de
Document Type
Doctoral Thesis
Issue Date
2009-11-19
Issue Year
2009
Authors
Hahn, Alexander
Editor
Abstract

Kaposi´s Sarcoma associated Herpesvirus (KSHV) is a human gamma-herpesvirus. It is causally associated with Kaposi´s sarcoma and two B-cell proliferative disorders, Primary Effusion Lymphoma (PEL) and Multicentric Castleman Disease. KSHV entry into host cells is only partially understood. A number of receptors have been implicated (xCT, integrins, heparan sulfate proteoglycans, DC-SIGN), but these receptors are neither necessary nor sufficient for infection of most cells. With the exception of heparan sulfate binding by the glycoproteins K8.1, gB and KCP, as well as the integrin-binding RGD-motif in gB, little is known about the interaction of individual glycoproteins with cellular receptors. The previ­ously uncharacterised protein FLJ40722, which was described in this work for the first time, was identified as a cellular receptor of K8.1 by immunoprecipitation and peptide mass fingerprinting. FLJ40722 was experimentally characterised as a membrane protein. Overexpression of FLJ40722 enhanced KSHV infection, whereas infection was inhibited by siRNA-mediated knock-down of FLJ40722 expression. Similar inhibition was observed with anti-sera directed against FLJ40722. For glycoproteins H and L, it could be shown that gL is a peripheral membrane protein that is exported and then tethered to the cell sur­face by gH. For gH, apart from the export of gL, a strong interaction with heparan sulfate proteoglycans, especially from the syndecan family, could be demonstrated. Correspond­ingly, expression of syndecans enhanced permissivity for KSHV. In addition, Ephrin A2 re­ceptor tyrosine kinase (EphA2) was identified as a high-affinity receptor for the gH/gL com­plex, again by immunoprecipitation and mass spectrometry. Overexpression of EphA2 en­hanced the permissivity for KSHV infection. Furthermore, KSHV was shown to induce phosphorylation of EphA2 within the first minutes of infection. Soluble EphA2-Fc fusion protein was recombinantly produced and purified. This soluble EphA2 receptor protein in­hibited KSHV infection with high efficiency at an effective concentration in the sub-nanomolar range and KSHV-mediated activation of EphA2 was reverted by soluble EphA2-Fc.

Abstract

Das Kaposi-Sarkom assoziierte Herpesvirus (KSHV) ist ein humanpathogenes Gamma­herpesvirus. Es ist mit dem Kaposi-Sarkom sowie mit zwei proliferativen B-Zellerkrankun­gen assoziiert, dem Primären Effusionslymphom (PEL) und der multizentrischen Castle­man Erkrankung. Der Eintritt von KSHV in Wirtszellen ist bisher nur teilweise aufgeklärt und verstanden. Einigen zellulären Proteinen (xCT, Integrine, Heparansulfat-Proteo­glykane, DC-SIGN) wurde bereits eine Rolle als Rezeptor bei der KSHV-Infektion zuge­schrieben. Diese scheinen aber weder zwingend notwendig noch alleine ausreichend für die Infizier­barkeit von Zellen zu sein. Mit Ausnahme der Heparansulfat-Bindung, vor allem durch die Glykoproteine K8.1 und gB, sowie der Integrin-bindenden RGD-Sequenz in gB, ist wenig bekannt über die Interaktion der viralen Glykoproteine mit zellulären Rezeptoren. In dieser Dissertation wurden die Glykoproteine K8.1 sowie gH und gL näher untersucht, vor allem im Hinblick auf ihre Interaktion mit zellulären Rezeptoren und deren Einfluss auf die KSHV-Infektion. Mit dem in dieser Arbeit erstmals beschriebenen und als Membran­protein cha­rakterisierten Protein FLJ40722 wurde für K8.1 durch Immunpräzipitation und Peptid­massenfingerabdruck ein zellulärer Rezeptor identifiziert. Überexpression von FLJ40722 erhöhte die Permissivität von murinen Fibroblasten für KSHV, während siRNA-vermittelter Knock-Down der FLJ40722-Expression ebenso wie anti-FLJ40722-Seren die KSHV-Infek­tion negativ beeinflussten. Für die Glykoproteine H und L konnte gezeigt wer­den, dass gL ein durch gH peripher an der Membran verankertes Protein ist, das durch gH auf die Außenseite der Membran exportiert wird. Für gH wiederum konnte neben der Ex­portfunktion für gL noch eine von gL unabhängige, starke Interaktion mit Heparansulfat-Proteo­glykanen, insbesondere aus der Familie der Syndekane, nachgewiesen werden. Expres­sion von Syndekanen erhöhte dementsprechend auch die Permissivität für KSHV. Eben­falls über Immunpräzipitation und Massenspektrometrie wurde für den Komplex aus gH und gL ein mit hoher Affinität erkannter Rezeptor identifiziert, die Ephrin Rezeptor-Tyro­sinkinase A2 (EphA2). Überexpression von EphA2 steigerte die Permissivität für KSHV deut­lich. Zudem konnte gezeigt werden, dass KSHV innerhalb weniger Minuten die Phos­phorylierung von EphA2 induziert. Lösliches EphA2-Fc Fusionsprotein wurde als Rezep­tor-Analogon rekombinant hergestellt und gereinigt. Dieses lösliche Rezeptorprotein inhi­bierte die KSHV-Infektion mit einer wirksamen Konzentration im sub-nanomolaren Bereich, ebenso wie die damit verbundene Phosphorylierung von EphA2.

DOI
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