Zelluläre Rezeptoren des Kaposi-Sarkomassoziierten Herpesvirus
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Kaposi´s Sarcoma associated Herpesvirus (KSHV) is a human gamma-herpesvirus. It is causally associated with Kaposi´s sarcoma and two B-cell proliferative disorders, Primary Effusion Lymphoma (PEL) and Multicentric Castleman Disease. KSHV entry into host cells is only partially understood. A number of receptors have been implicated (xCT, integrins, heparan sulfate proteoglycans, DC-SIGN), but these receptors are neither necessary nor sufficient for infection of most cells. With the exception of heparan sulfate binding by the glycoproteins K8.1, gB and KCP, as well as the integrin-binding RGD-motif in gB, little is known about the interaction of individual glycoproteins with cellular receptors. The previously uncharacterised protein FLJ40722, which was described in this work for the first time, was identified as a cellular receptor of K8.1 by immunoprecipitation and peptide mass fingerprinting. FLJ40722 was experimentally characterised as a membrane protein. Overexpression of FLJ40722 enhanced KSHV infection, whereas infection was inhibited by siRNA-mediated knock-down of FLJ40722 expression. Similar inhibition was observed with anti-sera directed against FLJ40722. For glycoproteins H and L, it could be shown that gL is a peripheral membrane protein that is exported and then tethered to the cell surface by gH. For gH, apart from the export of gL, a strong interaction with heparan sulfate proteoglycans, especially from the syndecan family, could be demonstrated. Correspondingly, expression of syndecans enhanced permissivity for KSHV. In addition, Ephrin A2 receptor tyrosine kinase (EphA2) was identified as a high-affinity receptor for the gH/gL complex, again by immunoprecipitation and mass spectrometry. Overexpression of EphA2 enhanced the permissivity for KSHV infection. Furthermore, KSHV was shown to induce phosphorylation of EphA2 within the first minutes of infection. Soluble EphA2-Fc fusion protein was recombinantly produced and purified. This soluble EphA2 receptor protein inhibited KSHV infection with high efficiency at an effective concentration in the sub-nanomolar range and KSHV-mediated activation of EphA2 was reverted by soluble EphA2-Fc.
Abstract
Das Kaposi-Sarkom assoziierte Herpesvirus (KSHV) ist ein humanpathogenes Gammaherpesvirus. Es ist mit dem Kaposi-Sarkom sowie mit zwei proliferativen B-Zellerkrankungen assoziiert, dem Primären Effusionslymphom (PEL) und der multizentrischen Castleman Erkrankung. Der Eintritt von KSHV in Wirtszellen ist bisher nur teilweise aufgeklärt und verstanden. Einigen zellulären Proteinen (xCT, Integrine, Heparansulfat-Proteoglykane, DC-SIGN) wurde bereits eine Rolle als Rezeptor bei der KSHV-Infektion zugeschrieben. Diese scheinen aber weder zwingend notwendig noch alleine ausreichend für die Infizierbarkeit von Zellen zu sein. Mit Ausnahme der Heparansulfat-Bindung, vor allem durch die Glykoproteine K8.1 und gB, sowie der Integrin-bindenden RGD-Sequenz in gB, ist wenig bekannt über die Interaktion der viralen Glykoproteine mit zellulären Rezeptoren. In dieser Dissertation wurden die Glykoproteine K8.1 sowie gH und gL näher untersucht, vor allem im Hinblick auf ihre Interaktion mit zellulären Rezeptoren und deren Einfluss auf die KSHV-Infektion. Mit dem in dieser Arbeit erstmals beschriebenen und als Membranprotein charakterisierten Protein FLJ40722 wurde für K8.1 durch Immunpräzipitation und Peptidmassenfingerabdruck ein zellulärer Rezeptor identifiziert. Überexpression von FLJ40722 erhöhte die Permissivität von murinen Fibroblasten für KSHV, während siRNA-vermittelter Knock-Down der FLJ40722-Expression ebenso wie anti-FLJ40722-Seren die KSHV-Infektion negativ beeinflussten. Für die Glykoproteine H und L konnte gezeigt werden, dass gL ein durch gH peripher an der Membran verankertes Protein ist, das durch gH auf die Außenseite der Membran exportiert wird. Für gH wiederum konnte neben der Exportfunktion für gL noch eine von gL unabhängige, starke Interaktion mit Heparansulfat-Proteoglykanen, insbesondere aus der Familie der Syndekane, nachgewiesen werden. Expression von Syndekanen erhöhte dementsprechend auch die Permissivität für KSHV. Ebenfalls über Immunpräzipitation und Massenspektrometrie wurde für den Komplex aus gH und gL ein mit hoher Affinität erkannter Rezeptor identifiziert, die Ephrin Rezeptor-Tyrosinkinase A2 (EphA2). Überexpression von EphA2 steigerte die Permissivität für KSHV deutlich. Zudem konnte gezeigt werden, dass KSHV innerhalb weniger Minuten die Phosphorylierung von EphA2 induziert. Lösliches EphA2-Fc Fusionsprotein wurde als Rezeptor-Analogon rekombinant hergestellt und gereinigt. Dieses lösliche Rezeptorprotein inhibierte die KSHV-Infektion mit einer wirksamen Konzentration im sub-nanomolaren Bereich, ebenso wie die damit verbundene Phosphorylierung von EphA2.