Marianne Menth

• Die Schilddrüse gehört zu den Organen mit dem höchsten Gehalt an Selen (Se). Dieses ist hauptsächlich in Form von Selenoproteinen gebunden. Hierzu gehören die 5'DI, die in den Stoffwechsel der Schilddrüsenhormone involviert ist, die TRxR, die unter anderem die Redoxstatus-abhängige Aktivität verschiedener Transkriptionsfaktoren reguliert, SePP, ein Protein, dem vor allem eine Funktion als Transportprotein zugeschrieben wird, und einige GPx, die während der H2O2-abhängigen Schilddrüsenhormonbiosynthese eine Rolle beim Abbau von H2O2 spielen. DieDie Schilddrüse gehört zu den Organen mit dem höchsten Gehalt an Selen (Se). Dieses ist hauptsächlich in Form von Selenoproteinen gebunden. Hierzu gehören die 5'DI, die in den Stoffwechsel der Schilddrüsenhormone involviert ist, die TRxR, die unter anderem die Redoxstatus-abhängige Aktivität verschiedener Transkriptionsfaktoren reguliert, SePP, ein Protein, dem vor allem eine Funktion als Transportprotein zugeschrieben wird, und einige GPx, die während der H2O2-abhängigen Schilddrüsenhormonbiosynthese eine Rolle beim Abbau von H2O2 spielen. Die Zelllinie XTC.UC1 ist eine hoch differenzierte Schilddrüsenkarzinom-Zelllinie. Sie wurde aus der Weichteilmetastase eines onkozytären Schilddrüsenkarzinoms (Hürthle-Zell-Karzinoms). Hürthle-Zell-Karzinome weisen charakteristische Anomalien auf, wie z.B. eine hohe Zahl an Mitochondrien und verminderten Iodidtransport. Vermehrte Mitochondrien erzeugen eine erhöhte Belastung durch reaktive Sauerstoffspezies (ROS). Dies wirft die Frage auf, ob die Expression von Selenoproteinen, die in erster Linie für den Schutz der Zellen vor oxidativer Schädigung verantwortlich sind, in Hürthle-Zell-Tumoren intakt ist. Im Rahmen der Arbeit wurde die Synthese der oben genannten Selenoproteine in XTC-Zellen überprüft. Retinsäure (RA) bewirkt bei mäßig differenzierten Schilddrüsenkarzinom-Zelllinien wie FTC 133 und 238 eine partielle Redifferenzierung. Aufgrund des seltenen Ansprechens auf eine Radioiodtherapie und der vergleichsweise hohen Tendenz oxyphiler Tumorzellen zur weiteren malignen Entartung wurde die Reaktion von XTC-Zellen auf eine Stimulation mit RA untersucht. Die Ergebnisse zeigen, dass die Aktivitäten der untersuchten Selenoproteine in XTC-Zellen mit den Aktivitäten in anderen Schilddrüsenzelllinien vergleichbar sind. Die GPx-Aktivität steigt nach Se-Behandlung bis zu einem Maximum bei 300 nmol/l Na2SeO3 an. In der Zeitkurve wird auch nach 144 h Inkubation kein Plateau erreicht. Sie ist klar von der Se-Konzentration im Kulturmedium abhängig und kann als Marker für den Se-Status betrachtet werden. Die Aktivität der TrxR wird in der Dosiskurve schon durch 1 nmol/l Na2SeO3 stimuliert und in der Kinetik nach 24 h. Beide Kurven steigen abrupt an und erreichen rasch ein Plateau. Höhere Na2SeO3-Konzentrationen oder längere Inkubation haben keinen zusätzlichen Effekt. GPx und TRxR können mittels Enzymassay auch in konditioniertem Medium nachgewiesen werden. Auch SePP kann im Western Blot aus konditioniertem Medium nachgewiesen werden, zeigt aber keine Reaktion auf Na2SeO3-Stimulation. Überraschende Ergebnisse zeigt die Untersuchung der 5'DI-Aktivität: Bei Passagenzahlen zwischen 20 und 22 wird die Aktivität der 5'DI zeit- und dosisabhängig durch Na2SeO3 stimuliert. Bei Passagenzahlen zwischen 28 und 31 reagiert die 5'DI nicht länger auf Stimulation mit Na2SeO3, kann aber durch zusätzliche Stimulation mit 1 µmol/l RA wieder induziert werden. Dieses ungleiche Ansprechen auf Se- und RA-Stimulation entspricht der unterschiedlichen Regulation des Enzyms in verschiedenen Schilddrüsenzelllinien: In differenzierten Zelllinien wie FRTL-5, wo eine hohe basale Aktivität an 5'DI vorhanden ist, zeigt RA keinen Einfluss. In eher entdifferenzierten follikulären Karzinom-Zelllinien wie FTC 133 und 238 ist die basale 5'DI-Aktivität niedrig, kann durch Behandlung mit RA aber induziert werden. Dieser Wechsel in der Reaktion auf Se und RA vollzieht vermutlich einen Teil der Veränderungen nach, die während der Entdifferenzierung normaler Thyrozyten zu follikulären Tumorzellen auftreten. Die Selenhierarchie unter den verschiedenen Selenoenzymen ist auch in XTC-Zellen intakt. Wie in anderen Systemen wird die 5'DI in XTC-Zellen im Vergleich zur cGPx bevorzugt mit Se versorgt. Bereits Konzentrationen von 1 nmol/l Na2SeO3 bewirken einen deutlichen Aktivitätszuwachs. Bei Se-Depletion kann man noch 5 Tage nach Beginn des Se-Entzugs 50 % der Maximalaktivität messen, Hinweis auf eine Umverteilung des Se zugunsten der 5'DI. Insgesamt sind also Expression und Aktivität der untersuchten Selenoenzyme in XTC-Zellen im Vergleich mit anderen Schilddrüsenzelllinien nicht erhöht, wie man es als Reaktion auf eine verstärkte Belastung durch ROS erwarten könnte. Andererseits ist die Aktivität auch nicht vermindert, was als Ursache für eine besonders ausgeprägte oxidative Zellschädigung inklusive DNA-Mutation und eine dadurch geförderte Tumorentstehung gewertet werden könnte. Diese Resultate bieten keinen Anhaltspunkt für eine Rolle von Selenoenzymen bei der Entstehung dieser Art von Schilddrüsentumoren. Ferner scheint die Responsivität verschiedener Selenoproteine auf Stimulation mit Na2SeO3 in XTC-Zellen von Passagenzahl oder Differenzierungsstadium abhängig zu sein. Diese Zelllinie könnte daher ein interessantes Modell darstellen, um das Ansprechen menschlicher Schilddrüsenkarzinome auf eine Redifferenzierungstherapie mit RA und evtl. Adjuvanzien wie Se weiter zu untersuchen.…
• The human thyroid is among the organs with the highest content in selenium, which is mainly incorporated in selenoproteins. Among them are the 5'deiodinase (5'DI), involved in thyroid hormone metabolism, thioredoxin reductase (TRxR), regulating the redox-status dependent activity of several transcription factors, Selenoprotein P (SePP), mainly acting as a transport protein, and several glutathionperoxidases (GPx), playing an important role in the degradation of H2O2 during the H2O2-dependent thyroid hormone biosynthesis. The cell line XTC.UC1The human thyroid is among the organs with the highest content in selenium, which is mainly incorporated in selenoproteins. Among them are the 5'deiodinase (5'DI), involved in thyroid hormone metabolism, thioredoxin reductase (TRxR), regulating the redox-status dependent activity of several transcription factors, Selenoprotein P (SePP), mainly acting as a transport protein, and several glutathionperoxidases (GPx), playing an important role in the degradation of H2O2 during the H2O2-dependent thyroid hormone biosynthesis. The cell line XTC.UC1 is a highly differentiated thyroid carcinoma cell line. It has been established from a metastasis of an oncocytic thyroid carcinoma (Hürthle cell carcinoma). Hürthle cell carcinoma display characteristic anomalies, e.g. a high amount of mitochondria and reduced iodide uptake. Amplified mitochondria generate a higher amount of reactive oxygen species (ROS). This raises the question, whether the expression of selenoproteins that are mainly responsible for protection of the cells from oxidative damage, is intact in Hürthle cell tumors. In this work the expression of the above mentioned selenoproteins has been analysed. Retinoic acid (RA) has a lot of positive effects in moderately differentiated thyroid carcinoma cell lines like FTC 133 and 238, leading to partial redifferentiation. Because of the rare positive responses to therapy with radioiodine and the relatively high tendency of oncocytic tumor cells to further dedifferentiation, the reaction of XTC cells to stimulation by RA has been analysed. Results: The activity of GPx showed a constant increase after treatment with Na2SeO3. In the time course even after 144 h of incubation the activity is still rising without reaching a plateau. So it is clearly dependent on the Na2SeO3 concentration in the culture medium and can therefore be regarded as a marker for the selenium status of the cell. The activity of TRxR is already stimulated by 1 nmol/l Na2SeO3 in the dose response experiments and after 24 h in the time course. Both curves are rapidly increasing and reaching a plateau very fast. Higher concentrations of Na2SeO3 or longer incubation do not have any additional effect. GPx and TRxR can be found also in conditioned media by enzymatic assays. SePP is found by western blot of conditioned medium however without showing any response to Na2SeO3. In conclusion, expression and activity of enzymes with antioxidative function are not augmented in XTC cells compared to other thyroid cell lines, what could be an expected reaction to an increased amount of ROS. On the other hand, the activity is neither decreased, what might be a cause for severe oxidative damage with mutation of the DNA and thus enhanced tumor initiation and progression. These results do not show any role of selenoenzymes in the development of this subspecies of thyroid cancer. The analysis of the activity of 5'DI, a differentiation marker for thyroid carcinoma, shows a very interesting result: at passages between 20 and 22 the activity of 5'DI is stimulated dependent on incubation time and concentration of Na2SeO3 comparable to GPx and TRxR. At passage numbers between 28 and 31, 5'DI does not react any longer to stimulation with Na2SeO3, but may be reinduced by additional stimulation with 1 µmol RA. This altered response to stimulation with Na2SeO3 and RA corresponds to the different regulation of the enzyme in different cell lines: In differentiated thyroid carcinoma like FRTL-5, 5'DI shows a high basal activity that cannot be influenced by retinoic acid. However, in less differentiated follicular carcinoma cell lines like FTC 133 and 238 with low basal 5'DI activity, the enzyme activity may be induced by additional treatment with RA. This change in the response to Se and RA is probably mimicking in part the alterations taking place during the dedifferentiation of normal thyrocytes to follicular tumor cells. The cell line XTC.UC1 may therefore be a useful model for studying the response of human thyroid carcinoma to redifferentiation therapy with RA and possible adjuvants such as Se. The selenium hierarchy among the different selenoenzymes is also intact in XTC cells. Like in other systems, 5'DI is preferentially supplied with Se compared to GPx. Concentrations of 0,1 nmol Na2SeO3 yield a significant increase in the enzyme activity. In Se-depleted cells, 5 days after begin of the withdrawal of Se 50 % of the maximum activity can still be detected. This can be regarded as a sign for redistribution of Se in the cell in advantage of 5'DI.…