Johanna Natalie Fiebeck [geb. Apfel]

• Der Wnt Signalweg spielt eine entscheidende Rolle in der Embryogenese durch Steuerung der Proliferation, Apoptose, Differenzierung und der Festlegung der Körperachsen im frühen Embryo. Eine Fehlregulation des Signalwegs durch Mutationen in einem der Proteine und Gene dieser hochkomplexen Signalkaskade kann fatale Folgen haben, und ist ein erster Schritt auf dem Weg der Krebsentstehung. Dabei spielt das Protein β-Catenin eine Schlüsselrolle im kanonischen Zweig des Wnt Signalwegs. Durch Steuerung seiner Konzentration im Zytoplasma wird dieDer Wnt Signalweg spielt eine entscheidende Rolle in der Embryogenese durch Steuerung der Proliferation, Apoptose, Differenzierung und der Festlegung der Körperachsen im frühen Embryo. Eine Fehlregulation des Signalwegs durch Mutationen in einem der Proteine und Gene dieser hochkomplexen Signalkaskade kann fatale Folgen haben, und ist ein erster Schritt auf dem Weg der Krebsentstehung. Dabei spielt das Protein β-Catenin eine Schlüsselrolle im kanonischen Zweig des Wnt Signalwegs. Durch Steuerung seiner Konzentration im Zytoplasma wird die Expression seiner direkten Zielgene reguliert, da β-Catenin im aktiven Signalweg als Co-Transkriptionsfaktor agiert. Durch Sichtbarmachung dieses Proteins durch fluoreszierende Reportergenkonstrukte kann der Aktivitätsstatus des Wnt Signalwegs in der Zelle beobachtet werden. Das ermöglicht zum einen genaue Analysen des Signalwegs, wie zum Beispiel das Studium des Zusammenspiels mit anderen Signalwegen. Vor allem aber erlaubt es die gezielte Suche nach Wnt-Signalwegs-modulierenden Substanzen als potentielle Wirkstoffe in der Krebsmedikamentenentwicklung. In der vorliegenden Arbeit wurden mehrere Reportergenkonstrukte für die stabile Transfektion von Zelllinien entwickelt und hinsichtlich eines möglichen Einsatzes sowohl in der Forschung, als auch in Wirkstoffscreenings validiert. Dies umfasst sowohl mehrere Reporter mit β-Catenin als Fusionsprotein, als auch Wnt-Promoter-regulierte eGFP-Reporter, die den Akitvitätsstatus des Wnt-Signalwegs anzeigen. Mit Hilfe dieser Reporter konnten Untersuchungen zur Wirkung des Wnt-Signalwegs auf die Morphologie von transfizierten und nicht-transfizierten MDCK-Zellen durchgeführt werden. Überdies wurde ein promotorregulierter eGFP-Reporter konstruiert, mit welchem transfizierte Zellen mit aktiviertem Wnt-Signalweg aus einem Zellpool gefischt werden können. Diese Methode ist sowohl für den Einsatz in kultivierten Zelllinien, als auch in der Diagnostik nach der Transfektion primärer Zellen geeignet. Auf Grundlage der neuen Zelllinien wurde weiterhin ein neuer Screeningansatz für potentielle Wnt-Signalwegsinhibitoren entwickelt, der auf dem Ausbleichen der Fluoreszenz in einem Well einer Multiwell-Kulturplatte beruht.…
• The Wnt signaling pathway plays a crucial role in embryogenesis because of its controlling of proliferation, apoptosis, differentiation and defining of the body axes. Mutations in one of the players of this complex pathway are leading to a deregulation, which have fatal consequences in the mentioned fields and are the first steps of a normal cell towards a cancer cell. β-catenin plays a key role in the canonical part of the pathway. Its concentration changes in the cytoplasm regulate the expression of the target genes: when its highThe Wnt signaling pathway plays a crucial role in embryogenesis because of its controlling of proliferation, apoptosis, differentiation and defining of the body axes. Mutations in one of the players of this complex pathway are leading to a deregulation, which have fatal consequences in the mentioned fields and are the first steps of a normal cell towards a cancer cell. β-catenin plays a key role in the canonical part of the pathway. Its concentration changes in the cytoplasm regulate the expression of the target genes: when its high concentration leads to a translocation into the nucleus, β-catenin acts as an activator of the transcription complex. By the use fluorescent reporters fused to this protein the activity state of the Wnt signaling pathway can be visualized. This allows the analysis of the pathway and its interaction with others or a specific screen for Wnt modulating substances as potential drugs in the drug development for cancer treatment. In the present doctoral thesis, several reporter constructs were established for transient and stable transfection of cell lines. They were validated regarding to a possible application in drug screening assays and their use for research. In detail this comprises constructs for tracking β-catenin within a living cell as a fusion protein as well as eGFP reporters which are promoter regulated for monitoring the Wnt signaling state. With the help of these reporters several studies were performed: An analysis of the involvement of the Wnt signaling pathway in morphologic changes in MDCK cells, transfected as well as wild-type, was carried out. Further, an eGFP reporter was shown to be able to fish Wnt active cells out of a pool of different cells after transfection. This approach may be applicable as well in cell research as in diagnostics. Based on the newly generated cell lines a novel careening assay approach was established: While bleaching transfected cells, potential Wnt inhibitors may be found and characterized in a screening assay.…