The Characterization of Nipah Virus V and W proteins

Die Charakterisierung der Nipah Virus V und W Proteine

Please always quote using this URN: urn:nbn:de:bvb:20-opus-37627
  • The work of the previous chapters describes the role of Nipah virus (NiV) V and W proteins regarding their role in interferon antagonism and regulation of viral replication. Previous publications have shown that NiV encodes IFN antagonist activity in its V, W and C protein (Park et al., 2003b; Rodriguez et al., 2002). In order to study the effect of both NiV proteins in the context of a virus infection, recombinant Newcastle disease viruses (rNDVs) expressing NiV V or NiV W were constructed. As a control virus served rNDV expressing NDV VThe work of the previous chapters describes the role of Nipah virus (NiV) V and W proteins regarding their role in interferon antagonism and regulation of viral replication. Previous publications have shown that NiV encodes IFN antagonist activity in its V, W and C protein (Park et al., 2003b; Rodriguez et al., 2002). In order to study the effect of both NiV proteins in the context of a virus infection, recombinant Newcastle disease viruses (rNDVs) expressing NiV V or NiV W were constructed. As a control virus served rNDV expressing NDV V proteins, which behaved like wildtype NDV. Growth kinetic experiments demonstrated that rNDVs expressing NiV V or W grew to higher titers than rNDV expressing NDV V in human A549 cells. This result suggested that both NiV V and W were able to render the avian virus, which normally does not replicate well in human cells, into a better growing virus. This hypothesis was supported by the fact that all rNDVs grew similarly in avian DF1 or Vero cells. When rNDV-infected A549 cells were specifically stained for NiV V or W protein it was observed that V is localized in the cytoplasm whereas W could be predominantly found in the nucleus. This observation was in agreement with previous studies reporting a nucleus export signal (NES) for NiV V and a nuclear localization signal (NLS) for NiV W (Rodriguez et al., 2004; Shaw et al., 2005). The specific localization of each NiV protein has also been shown to contribute to different functions in terms of IFN antagonism (Shaw et al., 2005). Here, NiV V and W proteins caused a severe attenuation of the immune response in rNDV-infected human A549 and dendritic cells. The transcription of type I interferons and ISGs was significantly downregulated in the presence of NiV V and W proteins. As a consequence of the transcriptional block, there was also an inhibition at the level of translation (as seen for A549 cells) and the secretion of IFNs and cytokines/chemokines (as seen for DCs). In contrast, NDV V protein induced a host immune response. Both NiV V and W also displayed a strong inhibitory effect on the function DCs. DCs represent a very important cell class because they link the innate immune response to the adaptive immune response (Banchereau & Steinman, 1998). By downregulating the production and secretion of important cytokines/chemokines that are important for the activation of B and T lymphocytes, NiV V and W were able to disrupt that link. Interestingly, NiV W seemed to be a stronger inhibitor than NiV V in both A549 cells and DCs. Overall, it was demonstrated that NiV V and W were able to prevent the induction of the innate and adaptive host immune response cascade by inhibiting the transcription of immune genes in DCs and A549 cells. The second part of this work addressed the question whether NiV V and W proteins have a regulatory role in viral replication. This has been previously reported for Nipah virus itself (Sleeman et al., 2008) and other viruses (Atreya et al., 1998; Horikami et al., 1996; Witko et al., 2006). In order to study the ability of the V and W proteins of NiV to regulate viral transcription and/or replication, an existing NiV minireplicon assay was used (Halpin et al., 2004). Here, it was shown that NiV V and W (but not C) proteins significantly downregulated NiV minireplicon activity. The common N terminal region was shown to harbor the inhibitory activity. Co-immunoprecipitation experiments showed that both NiV V and W (but not C) were able to interact with NiV N, one component of the NiV polymerase. This result was supported by immunofluorescence experiments that revealed co-localization of NiV N with V and W. The binding of NiV V or W to NiV N occurred via their N terminus and more specifically amino acids 1-50. This suggested that V and W might inhibit viral replication by interacting with the viral polymerase resulting in a loss of function. Exact mechanisms still have to be elucidated.show moreshow less
  • Die Arbeit der vorangegangenen Kapitel geht auf die Rolle von Nipah Virus (NiV) V und W Proteinen bezueglich deren Rolle im Interferon-Antagonismus und Regulation der viralen Replikation. In vergangenen Veroeffentlichungen wurde gezeigt, dass NiV seine interferon-antagonistische Aktivitaet in dessen V, W und C Proteinen kodiert (Park et al., 2003b; Rodriguez et al., 2002). Um den Effekt beider NiV Proteine im Rahmen einer Virusinfektion zu untersuchen, wurden rekombinante Newcastle disease Viren (rNDV), welche entweder NiV V oder W exprimieren,Die Arbeit der vorangegangenen Kapitel geht auf die Rolle von Nipah Virus (NiV) V und W Proteinen bezueglich deren Rolle im Interferon-Antagonismus und Regulation der viralen Replikation. In vergangenen Veroeffentlichungen wurde gezeigt, dass NiV seine interferon-antagonistische Aktivitaet in dessen V, W und C Proteinen kodiert (Park et al., 2003b; Rodriguez et al., 2002). Um den Effekt beider NiV Proteine im Rahmen einer Virusinfektion zu untersuchen, wurden rekombinante Newcastle disease Viren (rNDV), welche entweder NiV V oder W exprimieren, konstruiert. Als Kontrollvirus diente ein rNDV, der das NDV V Protein exprimiert. Dabei verhaelt sich der rekombinante Virus wie NDV-Wildtyp. Kinetische Wachstumsexperimente in A549 Zellen zeigten, dass rNDVs, die NiV V oder W exprimieren, zu hoeheren Titern wuchsen als rNDV, der NDV V exprimiert. Dieses Ergebnis deutete darauf hin, dass sowohl NiV V als auch NiV W im Stande waren, den Vogelvirus, welcher normalerweise schlecht in humanen Zellen repliziert, zu einem besseren Wachstum anzuregen. Diese Hypothese wurde durch die Tatsache unterstuetzt, dass alle rNDVs ein recht recht aehnliches Wachstumsverhalten in Vogelzellen (DF1 Zellen) und Vero Zellen aufwiesen. Ausserdem wurden rNDV-infizierte A549 Zellen spezifisch gegen NiV V oder W Protein angefaerbt und es konnte beobachtet werden, dass V im Zytoplasma und W ueberwiegend im Nukleus der Zelle lokalisiert ist. Diese Beobachtung stimmte mit vorhergehenden Studien ueberein, die von ein Nukleus-Exportsignal (NES) fuer NiV V und ein Nukleus-Lokalisationsignal (NLS) fuer NiV W berichteten (Rodriguez et al., 2004; Shaw et al., 2005). Es wurde gezeigt, dass diese unterschiedliche, jedoch spezifische Lokalisation der NiV Proteine zu verschiedenen Funktionen bezueglich des Interferon-Antagonismus beitraegt (Shaw et al., 2005). In der vorliegenden Arbeit verursachten NiV V und W Proteine eine heftige Attenuation der Immunantwort in rNDV-infizierten humanen A549 und dendritischen Zellen (DC). In der Anwesenheit von NiV V und W Proteinen wurde die Transkription der Typ 1-Interferonen und ISGs signifikant herunterreguliert. Als Konsequenz des transkriptionellen Blocks konnte auch eine Inhibition auf translationalem Niveau (zu sehen in A459 Zellen) und eine Inhibition der Sekretion von IFNs und Zytokinen/ Chemokinen (zu sehen in DCs) verzeichnet werden. Im Gegensatz dazu induzierte NDV V Protein ein Immunantwort im Wirt. Sowohl NiV V als auch W zeigten auch einen starken inhibitorischen Wirkung auf die Funktion von DCs. DCs repraesentieren einen sehr wichtigen Zelltyp, da sie eine Verbindung zwischen der angeborenen und erworbenen Immunantwort herstellen (Banchereau & Steinman, 1998). Durch die Herunterregulierung der Produktion und Sekretion wichtiger Zytokine/ Chemokine, die fuer die Aktivierung von B- und T-Lymphozyten wichtig sind, waren NiV V und W faehig, diese Verbindung zu zerstoeren. Interessanterweise schien NiV W in A549 Zellen ein viel staerkerer Inhibitor zu sein als NiV V. Insgesamt wurde demonstriert, dass NiV V und W durch Inhibierung der Transkription von Immungenen im Stande waren, die Induktion der angeborenen und erworbenen Immunantwort-Kaskade zu unterbinden. Der zweite Teil dieser Arbeit beschaeftigt sich mit der Frage, ob NiV V oder W Proteine eine regulatorische Aufgabe in der viralen Replikation uebernehmen. Vorherige Berichte hatten dies fuer Nipah Virus selbst (Sleeman et al., 2008) und andere Viren demonstriert (Atreya et al., 1998; Horikami et al., 1996; Witko et al., 2006). Um die Faehigkeit von V und W Proteinen bezueglich der Regulation der viralen Transkription und/ oder Replikation zu bestimmen, wurde Gebrauch von einem bereits existierenden NiV Minireplikon-Assay gemacht (Halpin et al., 2004). In der vorliegenden Studie wurde gezeigt, dass NiV V und W (jedoch nicht C) Proteine die NiV Minireplikon-Aktivitaet in signifikanter Weise reduzierten. Es wurde gezeigt, dass die gemeinsame N-terminale Region die inhibitorische Aktivitaet besitzt. Ko-Immunopraezipitationsexperimente demonstrierten weitehin, dass sowohl NiV V als auch W (jedoch nicht C) im Stande waren, mit NiV N, einer Komponente der NiV Polymerase, zu interagieren. Dieses Ergebnis wurde von Immunfluoreszenzexperimenten untermauert, die eine Kolokalisation zwischen NiV N und V und W demonstrierten. Der N-Terminus von NiV V und W, und hierbei speziell die Aminosaeuren 1-50, waren fuer die Bindung von NiV V und W an NiV N verantwortlich. Dies deutete darauf hin, dass V und W durch das Binden der viralen Polymerase die virale Replikation inhibiert.show moreshow less

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Metadaten
Author: Carolin Alexandra Guenzel
URN:urn:nbn:de:bvb:20-opus-37627
Document Type:Doctoral Thesis
Granting Institution:Universität Würzburg, Fakultät für Biologie
Faculties:Medizinische Fakultät / Institut für Virologie und Immunbiologie
Date of final exam:2009/07/29
Language:English
Year of Completion:2009
Dewey Decimal Classification:5 Naturwissenschaften und Mathematik / 57 Biowissenschaften; Biologie / 570 Biowissenschaften; Biologie
GND Keyword:Viren; Interferon; Immunreaktion; Replikation
Tag:Immunsupression; Interferonantagonismus
Immunesupression; Interferonantagonism
Release Date:2009/11/06
Advisor:Prof. Dr. Axel Rethwilm