Katrin Singethan

• CD9 und andere Mitglieder der Tetraspaninfamilie sind an der strukturellen Organisation und der Plastizität der Plasmamembran beteiligt. Dabei inhibiert mAK K41, ein spezifischer CD9-Antikörper, die Hundestaupe-induzierte Zell-Zellfusion und die Virusfreisetzung, während die MV-induzierte Zell-Zellfusion nicht beeinflusst wird. So ist die extrazelluläre Domäne des Hämagglutinin-Proteins von CDV diejenige, die die Empfindlichkeit der Zell-Zellfusion gegenüber dem CD9-Antikörper verursacht, die aber selbst nicht an das CD9-Molekül bindet. DieseCD9 und andere Mitglieder der Tetraspaninfamilie sind an der strukturellen Organisation und der Plastizität der Plasmamembran beteiligt. Dabei inhibiert mAK K41, ein spezifischer CD9-Antikörper, die Hundestaupe-induzierte Zell-Zellfusion und die Virusfreisetzung, während die MV-induzierte Zell-Zellfusion nicht beeinflusst wird. So ist die extrazelluläre Domäne des Hämagglutinin-Proteins von CDV diejenige, die die Empfindlichkeit der Zell-Zellfusion gegenüber dem CD9-Antikörper verursacht, die aber selbst nicht an das CD9-Molekül bindet. Diese Erkenntnisse ließen vermuten, dass strukturelle Veränderungen an der Plasmamembran der Grund für die Hemmung sind bzw. räumliche Expressionsmuster des Rezeptors involviert sein könnten. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass mAK K41 das Konformationsepitop der großen extrazellulären Domäne (LEL) von CD9 erkennt, die nachweislich über ß1-Integrin mit verschiedenen Signalwegen im Innern in Kontakt steht. Die Bindung dieser Domäne induziert folglich eine schnelle Umlagerung und ein Clustern der CD9-Moleküle bis zur Bildung von netzähnlichen Strukturen an den Kontaktstellen zweier Zellen. Durch konfokale und rasterelektronenmikroskopische Untersuchungen konnten mikrovilli-ähnliche Ausstülpungen aufgedeckt werden, die von beiden Seiten aneinander liegender Zellen gebildet werden. Nach einer Zeitspanne von 2 h bis 20 h bildeten diese CD9-haltigen Ausstülpungen feine, mehrere µm lange Mikrovilli aus, die sich in einer Art Geflecht miteinander vernetzten und mikrovilli-artige Reißverschlussstrukturen bildeten. Weiterhin konnte eine starke Kolokalisierung des Ewi-F-Proteins vor und nach der Antikörperinkubation gezeigt werden, sowie eine partielle Kolokalisierung mit ß1-Integrin. Im Vergleich konnten MV-Proteine innerhalb der CD9-haltigen Netzstrukturen beobachtet werden, während CDV-Proteine komplett aus diesen ausgeschlossen wurden. Somit ist die Ausgrenzung der viralen Fusionsmaschinerie von CDV von den CD9-Clustern sowie die physikalische Trennung von den Zellkontakten wohl die Erklärung für die Inhibition der Virus-induzierten Zell-Zellfusion durch mAK K41. Da experimentell keine kausale Verbindung zwischen der Induktion der CD9-haltigen Cluster und bestimmten Signalwegen gezeigt werden und auch kein Beweis hervorgebracht werden konnte, dass die Grundlage der Netzstrukturen durch die Umlagerung des Zytoskeletts entsteht, scheint die Interaktion des Antikörper selbst die treibende Kraft für die Strukturbildung zu sein (Singethan et al., 2008). Zusammenfassend ist zu sagen, dass die Ergebnisse die Relevanz des CD9-Moleküls in gesunden und pathogenen Zell-Zellfusionsprozessen unterstreichen und eindeutig zeigen, dass CD9 die Zellfusion von CDV steuern kann, indem es den Zugang der Fusionsmaschinerie zu den Zellgrenzen reguliert. Das Nipah-Virus (NiV) ist ein hochpathogenes Paramyxovirus, das in Schweinen eine Erkrankung des Respirationstrakts und in Menschen eine schwere fiebrige Enzephalitis mit hohen Mortalitätsraten verursacht. Da es noch keine Vakzine bzw. antivirale Medikamente gegen dies Erkrankung gibt, war die Entwicklung kleiner inhibitorischer Moleküle notwendig. Für das Masern-Virus (MV) wurden bereits kleine Inhibitoren, wie Ox-1, AM-2 und AS-48 entwickelt, die in die Bindungstasche des MV F-Proteins passen und so die Membranfusion verhindern. Basierend auf struktureller Ähnlichkeiten der Paramyxovirus F-Proteine konnte ein Testsystem mit F- und H- oder G-exprimierenden Vektoren entwickelt werden, indem eine Gruppe von Chinolon-Derivaten sowie mehrere andere Substanzen auf ihre Fähigkeit untersucht wurden, die eine MV-, CDV- oder NiV-spezifische Fusion zu hemmen. Dazu wurde zuerst die Zytotoxizität aller Substanzen bewertet, um anschließend ihre Hemmungsaktivität in Zell-Zellfusion-Assays zu untersuchen. So inhibierten zwei Substanzen, QED15B - 12 und QED15A - 12, aus der Gruppe der Chinolon-Derivate die NiV-induzierte Synzytienbildung in Hüllprotein-Transfektions- und Infektions-Assays. Bei molekularen Untersuchungen der Bindungstasche des NiV F-Proteins wurde die hemmende Aktivität beider Chinolon-Derivate bestätigt. So konnte eine hervorragende Wechselwirkung und strukturelle Paßform für die Protein-Bindetasche identifiziert werden und deren Interaktion bewiesen werden. Somit konnte die Substanzklasse der Chinolone als Inhibitoren gegen die NiV-Fusion identifiziert und der Mechanismus der Interaktion mit der Bindetasche als Grund für die inhibierende Wirkung aufgeklärt werden (Niedermeier S. und Singethan K. et al., 2008 zur Veröffentlichung eingereicht). Dabei sind diese Chinolon-Derivate mit ihrer Struktur, die völlig verschieden von den meisten aktiven Molekülen gegen die Masern-induzierte Zellfusion sind, eine vielversprechende neue Verbindungsstruktur, auf der weitere Entwicklungen neuer Inhibitoren und antiviraler Agentien aufgebaut werden können. Letztlich sollte ein Testsystem für Untersuchungen der Dengue-Virus……
• Members of the tetraspanin family including CD9 contribute to the structural organization and plasticity of the plasma membrane. K41, a CD9-specific mAb, inhibits canine distemper virus (CDV) induced cell-to-cell fusion and virus release, whereas measles virus (MV) induced cell-to-cell fusion is not affected. The extracellular domain of the viral haemagglutinin (H) of CDV determines the susceptibility of cell-cell fusion to certain CD9-antibodies, however does not itself bind to CD9. This suggested that structural alterations of the plasmaMembers of the tetraspanin family including CD9 contribute to the structural organization and plasticity of the plasma membrane. K41, a CD9-specific mAb, inhibits canine distemper virus (CDV) induced cell-to-cell fusion and virus release, whereas measles virus (MV) induced cell-to-cell fusion is not affected. The extracellular domain of the viral haemagglutinin (H) of CDV determines the susceptibility of cell-cell fusion to certain CD9-antibodies, however does not itself bind to CD9. This suggested that structural alterations of the plasma membrane influencing the activity and/or spatial expression pattern of receptors are involved. In the present thesis we found that K41, which recognizes a conformational epitope on the large extracellular loop (LEL) of CD9, induces rapid relocation and clustering of CD9 in net-like structures especially at contact areas between two cells. The high resolution analyses by confocal and electron microscope revealed that CD9 clustering is accompanied by the formation of microvilli-like protrusions that are formed from both sides of adjacent cell surfaces. After about 2 h to 20 h the protrusions are forming more and more structures like microvilli zippers. While the cellular CD9-associated protein EWI-F is co-clustering with CD9 at cell contact areas after and before mAb K41 treatment, the ß1-integrin can only partially be found within the CD9 structures built at the cell interfaces. In contrast viral proteins in infected cells were differentially affected by the treatment of mAb K41. While MV envelope proteins were detected within the microvilli zippers, the CDV proteins were displaced and excluded from CD9 clusters. The exclusion of the viral fusion machinery and its physical separation from cell contact areas explains the inhibition of virus-induced cell-cell fusion by K41. Since we have no experimental support that signal transduction and remodeling of the cytoskeleton may drive the clustering, it is more likely that the antibody interaction on the cell surface is the driving force (Singethan et al., 2008). Although it is known that LEL is interacting with ß1-Integrin and inducing signaling pathways within the cell, it was not possible to find any evidence for the involvement of any signaling pathway.The findings underscore the relevance of the tetraspanin CD9 for healthy and pathogenic cell-to-cell fusion processes and clearly show that CD9 can regulate cell-cell fusion by controlling the access of the fusion machinery of CDV to cell contact areas. Nipah virus (NiV), a highly pathogenic paramyxovirus, causes a respiratory disease in pigs and severe febrile encephalitis in humans with high mortality rates. There is no vaccine and no antiviral treatment available until now. Small molecule inhibitors, like Ox-1, AM-2 or AS-48, fitting into a pocket of the measles virus (MV) F protein and preventing membrane fusion have been designed earlier. Based on the structural similarity of viral fusion (F) proteins within the family Paramyxoviridae, we tested a library of quinolone derivatives and several other small molecules in a NiV, CDV and MV envelope protein-based fusion assay. The cytotoxicity of all substances was evaluated and they were tested for their ability to inhibit cell-to-cell fusion induced by the three mentioned viruses. The most active molecules, QED15A-12 and QED15B-12, inhibiting the syncytium formation induced by transfection of pCz-CFG5-NiV-F and -G and infection with NiV, revealed aan active quinolone-type compound structure, which is different from the most active molecules against MV induced cell fusion. In conclusion, this study revealed a class of promising compounds fitting into a protein cavity of the NiV F protein and inhibiting NiV-induced cell-cell fusion (Niedermeier S. and Singethan K. et al., 2008 submitted for publication). Finally we had the aim to establish a test system for investigations of the Dengue-Virus envelope protein induced virus-cell fusion using DENV-E pseudotyped retroviral particles. This should open an experimental way to develop small inhibitory peptides and molecules against the Dengue E-protein, which mediates the fusion of the viral membrane with the cellular membrane, working under BSL-2 conditions. As there is not sufficient information about intermediate conformational stages of the class II fusion proteins during the fusion process, similarities to the class I proteins should help to develop highly active antiviral peptides inhibiting this process. Although cloning of DENV-3-E-cDNA in the pCG-eGFP vector lead to a high expression of the E-protein, the test system based on pseudotyped retroviral particles could not be established. Even though there were used several different modification strategies like exchanging 3´protein tails in order to get a protein with a tail of the envelope protein of MuLV, which should lead to a better packaging into the pseudotyped particle system based on MuLV……