Franziska Weigl

• This thesis aimed the development of a correlated device which combines FluidFM® with Fluorescence Microscopy (FL) (FL-FluidFM®) and enables the simultaneous quantification of adhesion forces and fluorescent visualization of mature cells. The implementation of a PIFOC was crucial to achieve a high-resolution as well as a stable but dynamic focus level. The functionality of SCFS after hardware modification was verified by comparing two force-curves, both showing the typical force progression and measured with the optimized and conventionalThis thesis aimed the development of a correlated device which combines FluidFM® with Fluorescence Microscopy (FL) (FL-FluidFM®) and enables the simultaneous quantification of adhesion forces and fluorescent visualization of mature cells. The implementation of a PIFOC was crucial to achieve a high-resolution as well as a stable but dynamic focus level. The functionality of SCFS after hardware modification was verified by comparing two force-curves, both showing the typical force progression and measured with the optimized and conventional hardware, respectively. Then, the integration of FL was examined by detaching fluorescently labeled REF52 cells. The fluorescence illumination of the cytoskeleton showed the expected characteristic force profile and no evidence of interference effects. Afterwards a corresponding correlative data analysis was addressed including manual force step fitting, the identification of visualized cellular unbinding, and a time-dependent correlation. This procedure revealed a link between the area of cytoskeletal unbinding and force-jumps. This was followed by a comparison of the detachment characteristics of intercellular connected HUVECs and individual REF52 cells. HUVECs showed maximum detachment forces in the same order of magnitude as the ones of single REF52 cells. This contrasted with the expected strong cohesiveness of endothelial cells and indicated a lack of cell-cell contact formation. The latter was confirmed by a comparison of HUVECs, primary HBMVECs, and immortalized EA.hy926 cells fluorescently labeled for two marker proteins of intercellular junctions. This unveiled that both the previous cultivation duration and the cell type have a major impact on the development of intercellular junctions. In summary, the correlative FL FluidFM® represents a powerful novel approach, which enables a truly contemporaneous performance and, thus, has the potential to reveal new insights into the mechanobiological properties of cell adhesion.…
• Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung eines korrelierten Gerätes, das FluidFM® mit Fluoreszenzmikroskopie (FL) kombiniert (FL-FluidFM®) und die gleichzeitige Quantifizierung von Adhäsionskräften und Fluoreszenzvisualisierung ausgereifter Zellen ermöglicht. Die Implementierung eines PIFOC war entscheidend, um eine hohe Auflösung sowie ein stabiles, aber dynamisches Fokusniveau zu erreichen. Die Funktionalität der SCFS nach der Hardwaremodifikation wurde durch den Vergleich zweier Kraftkurven verifiziert, die beide den typischen KraftverlaufZiel dieser Arbeit war die Entwicklung eines korrelierten Gerätes, das FluidFM® mit Fluoreszenzmikroskopie (FL) kombiniert (FL-FluidFM®) und die gleichzeitige Quantifizierung von Adhäsionskräften und Fluoreszenzvisualisierung ausgereifter Zellen ermöglicht. Die Implementierung eines PIFOC war entscheidend, um eine hohe Auflösung sowie ein stabiles, aber dynamisches Fokusniveau zu erreichen. Die Funktionalität der SCFS nach der Hardwaremodifikation wurde durch den Vergleich zweier Kraftkurven verifiziert, die beide den typischen Kraftverlauf zeigten und jeweils mit der optimierten bzw. konventionellen Hardware gemessen wurden. Anschließend wurde die Integration von FL durch das Ablösen fluoreszenzmarkierter REF52-Zellen untersucht. Unter Fluoreszenzbeleuchtung des Zytoskeletts zeigte sich das erwartete charakteristische Kraftprofil und kein Hinweis auf Störeffekte. Anschließend wurde eine entsprechende korrelative Datenanalyse durchgeführt, die eine manuelle Kraftstufenanpassung, die Identifizierung der visualisierten zellulären Ablösung und eine zeitabhängige Korrelation umfasste. Dieses Verfahren ergab einen Zusammenhang zwischen dem Bereich der Zytoskelett-Ablösung und den Kraftsprüngen. Es folgte ein Vergleich der Ablösungseigenschaften von interzellulär verbundenen HUVECs und einzelnen REF52-Zellen. HUVECs zeigten maximale Ablösekräfte in der gleichen Größenordnung wie die von einzelnen REF52-Zellen. Dies stand im Gegensatz zu der erwarteten starken Kohäsion von Endothelzellen und deutete auf eine fehlende Zell-Zell-Kontaktbildung hin. Letzteres wurde durch einen Vergleich von HUVECs, primären HBMVECs und immortalisierten EA.hy926-Zellen bestätigt, die für zwei Markerproteine für interzelluläre Verbindungen fluoreszierend markiert wurden. Dabei zeigte sich, dass sowohl die vorherige Kultivierungsdauer als auch der Zelltyp einen großen Einfluss auf die Entwicklung von interzellulären Verbindungen haben. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das korrelative FL-FluidFM® einen leistungsstarken neuen Ansatz darstellt, der eine korrelative Durchführung ermöglicht und somit das Potenzial hat, neue Erkenntnisse über die mechanobiologischen Eigenschaften der Zelladhäsion zu liefern…