Martin Frederik von Rüden

• A part of the plant kingdom consists of a variety of carnivorous plants. Some trap their prey using sticky leaves, others have pitfall traps where prey cannot escape once it has fallen inside. A rare trap type is the snap-trap: it appears only twice in the plant kingdom, in the genera Aldrovanda and Dionaea. Even Charles Darwin himself described Dionaea muscipula, the Venus flytrap, with the following words “This plant, commonly called Venus' fly-trap, from the rapidity and force of its movements, is one of the most wonderful in theA part of the plant kingdom consists of a variety of carnivorous plants. Some trap their prey using sticky leaves, others have pitfall traps where prey cannot escape once it has fallen inside. A rare trap type is the snap-trap: it appears only twice in the plant kingdom, in the genera Aldrovanda and Dionaea. Even Charles Darwin himself described Dionaea muscipula, the Venus flytrap, with the following words “This plant, commonly called Venus' fly-trap, from the rapidity and force of its movements, is one of the most wonderful in the world”. For a long time now, the mechanisms of Dionaea’s prey recognition, capture and utilization are of interest for scientists and have been studied intensively. Dionaea presents itself with traps wide-open, ready to catch insects upon contact. For this, the insect has to touch the trigger hairs of the opened trap twice within about 20-30 seconds. Once the prey is trapped, the trap lobes close tight, forming a hermetically sealed “green stomach”. Until lately, there was only limited knowledge about the molecular and hormonal mechanisms which lead to prey capture and excretion of digestive fluids. It is known that the digestion process is very water-consuming; therefore, the interplay of digestion-inducing and digestion inhibiting substances was to be analyzed in this work, to elucidate the fine-tuning of the digestive pathway. Special attention was given to the impact of phytohormones on mRNA transcript levels of digestion-related proteins after various stimuli as well as their effect on Dionaea’s physiological responses. Jasmonic acid (JA) and its isoleucine-conjugated form, JA-Ile, are an important signal in the jasmonate pathway. In the majority of non-carnivorous plants, jasmonates are critical for the defense against herbivory and pathogens. In Dionaea, this defense mechanism has been restructured towards offensive prey catching. One question in this work was how the frequency of trigger hair bendings is related to the formation of jasmonates and the induction of the digestion process. Upon contact of a prey with the trigger hairs in the inside of the trap, the trap closes and jasmonates are produced biosynthetically. JA-Ile interacts with the COI1- receptor, thereby activating the digestion pathway which leads to the secretion of digestive fluid and production of transporters needed to take up prey-derived nutrients. In this work it could be shown that the number of trigger hair bendings is positively correlated with the level and duration of transcriptional induction of several digestive enzymes/hydrolases. Abscisic acid (ABA) acts, along with many other functions, as the plant “drought stress hormone”. It is synthesized either by roots as the primary sensor for water shortage or by guard cells in the leaves. ABA affects a network of several thousand genes whose regulation prepares the plant for drought and initiates protective measurements. It was known from previous work that the application of ABA for 48 hours increased the required amount of trigger hair bendings to achieve trap closure. As the digestion process is very water-intensive, the question arose how exactly the interplay between the jasmonate- and the ABA-pathway is organized, and if ABA could stop the running digestion process once it had been activated. In the present work it could be shown that the application of ABA on intact traps prior to mechanically stimulating the trigger hairs (mechanostimulation) already significantly reduced the transcription of digestive enzymes for an incubation time as short as 4 h, showing that already short-term exposure to ABA counteracts the effects of jasmonates when it comes to initiating the digestion process, but does not inhibit trap closure. Incubation for 24 and 48 hours with 100 μM active ABA had no effect on trap reopening, only very high levels of 200 μM of active ABA inhibited trap reopening but also led to tissue necrosis. As the application of ABA could reduce the transcription of digestive hydrolases, it is likely that Dionaea can stop the digestion process, if corresponding external stimuli are received. Another factor, which only emerged later, was the effect of the wounding-induced systemic jasmonate burst. As efficient as ABA was in inhibiting marker hydrolase expression after mechanostimulation in intact plants, the application of ABA on truncated traps was not able to inhibit mechanostimulation-induced marker hydrolase expression. One reason might be that the ABA-signal is perceived in the roots, and therefore truncated traps were not able to react to it. Another reason might be that the wounding desensitized the tissue for the ABAsignal. Further research is required at this point. Inhibitors of the jasmonate pathway were also used to assess their effect on the regulation of Dionaea´s hunting cycle. Coronatine-O-methyloxime proved to be a potent inhibitor of mechanostimulation-induced expression of digestive enzymes, thus confirming the key regulatory role of jasmonates for Dionaea´s prey consumption mechanism. In a parallel project, the generation of in vitro cultures from sterilized seeds and single plant parts proved successful, which may be important for stock-keeping of future transgenic lines. Protoplasts were generated from leaf blade tissue and transiently transformed, expressing the reporter protein YFP after 24 h of incubation. In the future this might be the starting point for the generation of transgenic lines or the functional testing of DNA constructs.…
• Ein Teil des Pflanzenreiches besteht aus einer Vielfalt fleischfressender Pflanzen. Einige fangen ihre Beute mit klebrigen Blättern, andere haben Grubenfallen, aus denen die Beute nicht mehr entkommen kann, wenn sie erst einmal hineingefallen ist. Ein seltener Fallentyp ist die Klappfalle: Sie kommt im Pflanzenreich nur zweimal vor, in den Gattungen Aldrovanda und Dionaea. Charles Darwin selbst beschrieb Dionaea muscipula, die Venusfliegenfalle, als "eine der schönsten Pflanzen der Welt". Die Mechanismen der Erkennung, des Fangs undEin Teil des Pflanzenreiches besteht aus einer Vielfalt fleischfressender Pflanzen. Einige fangen ihre Beute mit klebrigen Blättern, andere haben Grubenfallen, aus denen die Beute nicht mehr entkommen kann, wenn sie erst einmal hineingefallen ist. Ein seltener Fallentyp ist die Klappfalle: Sie kommt im Pflanzenreich nur zweimal vor, in den Gattungen Aldrovanda und Dionaea. Charles Darwin selbst beschrieb Dionaea muscipula, die Venusfliegenfalle, als "eine der schönsten Pflanzen der Welt". Die Mechanismen der Erkennung, des Fangs und der Nutzbarmachung von Beutetieren durch Dionaea sind seit langem von Interesse für die Wissenschaft und wurden intensiv untersucht. Dionaea hat weit geöffnete Fallen, die bei Kontakt Insekten fangen können. Dazu muss das Insekt innerhalb von ca. 20-30 Sekunden zweimal die Triggerhaare der geöffneten Falle berühren. Sobald die Beute gefangen ist, schließen sich die Fallenhälften fest und bilden einen hermetisch verschlossenen sogenannten „grünen Magen“. Bis vor einigen Jahren gab es nur wenige Informationen über die molekularen und hormonellen Mechanismen, die zu Beutefang und Sekretion von Verdauungsflüssigkeiten führen. Es ist bekannt, dass der Verdauungsprozess sehr viel Wasser verbraucht; daher sollte in dieser Arbeit das Zusammenspiel von verdauungsauslösenden und verdauungshemmenden Substanzen untersucht werden, um die Feinabstimmung des Verdauungsweges aufzuklären. Ein besonderes Augenmerk wurde auf den Einfluss von Phytohormonen auf die mRNATranskriptzahlen von Verdauungsproteinen nach verschiedenen Stimuli sowie auf deren Auswirkungen auf die physiologischen Reaktionen von Dionaea gelegt. Jasmonsäure (JA) und ihre mit Isoleucin konjugierte Form, JA-Ile, sind ein wichtiges Signal in pflanzlichen Signaltransduktionsprozessen. In der Mehrzahl der nicht-karnivoren Pflanzen sind Jasmonate entscheidend für die Abwehr von Herbivoren und Pathogenen. In Dionaea wurde dieser Abwehrmechanismus für den offensiven Beutefang umstrukturiert. Eine Frage in dieser Arbeit war also, wie die Häufigkeit der Triggerhaarberührungen mit der Bildung von Jasmonaten und dem Verdauungsvorgang miteinander in Verbindung steht. Beim Kontakt von Beute mit den Triggerhaaren im Inneren der Falle schließt sich diese, und es werden durch Biosynthese Jasmonate gebildet. JA-Ile interagiert mit dem COI1-Rezeptor und aktiviert so den Verdauungsweg, der zur Sekretion von Verdauungsflüssigkeit und zur Produktion von Transportern führt, welche zur Aufnahme von aus Beute gewonnenen Nährstoffen benötigt werden. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Anzahl der Triggerhaarberührungen positiv mit der Höhe und der Dauer der Transkriptionsinduktion mehrerer Verdauungsenzyme bzw. Verdauungshydrolasen korreliert. Abscisinsäure (ABA) fungiert neben vielen anderen Funktionen als pflanzliches „Trockenstresshormon“. Es wird entweder von Wurzeln als primärem Sensor für Wassermangel oder von Schließzellen in den Blättern synthetisiert. ABA beeinflusst ein Netzwerk von mehreren tausend Genen, deren Regulation die Pflanze auf Dürre vorbereitet und entsprechende Schutzmaßnahmen einleitet. Aus früheren Arbeiten war bekannt, dass die 48-stündige Inkubation einer Dionaea-Falle mit ABA die erforderliche Anzahl an Triggerhaarberührungen erhöhte, die für einen Fallenschluss notwendig sind. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass das Aufbringen von ABA auf intakte Fallen vor der mechanischen Stimulierung der Triggerhaare (Mechanostimulation) die Expression von Verdauungsenzymen bereits bei einer Inkubationszeit von nur 4 Stunden signifikant reduzierte. Das zeigte eindeutig, dass die kurzzeitige Einwirkung von ABA bereits die Effekte von Jasmonaten blockiert, wenn es um den Beginn des Verdauungsprozesses geht, aber keinen Einfluss auf den Fallenschluss hat. Eine Inkubation für 24 und 48 Stunden mit 100 μM aktiver ABA hatte keine Auswirkung auf das Wiederöffnen der Falle, nur sehr hohe Konzentrationen von 200 μM aktiver ABA hemmten das Wiederöffnen der Falle, führten aber auch zu Gewebenekrose. Da ABA die Transkription der Verdauungsenzyme reduzieren konnte, ist es wahrscheinlich, dass Dionaea den Verdauungsvorgang stoppen kann, wenn entsprechende externe Signale empfangen werden. Ein weiterer Einflussfaktor, welcher erst später erkannt wurde, war die Auswirkung des verwundungsbedingten, sprunghaften systemischen Anstiegs der Jasmonatkonzentration auf die Wirkung von extern aufgegebenen Phytohormonen. So wirksam ABA bei der Hemmung der Markerhydrolasen-Expression nach Mechanostimulation in intakten Pflanzen war, so konnte diese Inhibition nach Anwendung von ABA auf abgeschnittenen Fallen nicht mehr beobachtet werden. Ein Grund könnte sein, dass das ABA-Signal in den Wurzeln wahrgenommen wird und daher abgeschnittene Fallen nicht darauf reagieren konnten. Ein anderer Grund könnte sein, dass die Verwundung das Gewebe für das ABA-Signal desensibilisiert hat. An dieser Stelle besteht weiterer Forschungsbedarf. Ebenfalls wurden Inhibitoren des Jasmonat-Weges verwendet, um ihre Wirkung auf die Regulation des Beutefangzyklus von Dionaea zu untersuchen. Coronatine-O-methyloxim erwies sich als wirksamer Inhibitor der durch Mechanostimulation induzierten Expression von Verdauungsenzymen und bestätigte damit die zentrale regulatorische Rolle von Jasmonaten für den Beutefangmechanismus von Dionaea. Ein parallel laufendes Projekt war die Erzeugung von in vitro-Kulturen aus sterilisiertem Saatgut und einzelnen Pflanzenteilen, das sich als sehr erfolgreich erwies, was für die Erzeugung zukünftiger transgener Linien wichtig sein kann. Ebenfalls wurden Protoplasten aus Blattgewebe erzeugt, diese wurden transient transformiert und exprimierten YFP nach einer Inkubationszeit von 24 Stunden. In Zukunft könnte dies der Ausgangspunkt für die Generierung transgener Linien sein und der Funktionsüberprüfung von DNA-Konstrukten sein.…