USP 10 als Deubiquitinase für β-Catenin

USP 10 as a Deubiquitinase for β-Catenin

Please always quote using this URN: urn:nbn:de:bvb:20-opus-272998
  • Der WNT-Signalweg ist ein hochkonservierter Signalweg, dessen zentraler intrazellulärer Regulationsschritt die Proteinstabilität des Proteins β-Catenin ist. Deregulierende Mutationen in diesem sind frühe Ereignisse bei der Entstehung von Darmtumoren. Ist der Abbau von β-Catenin gestört, so ist unabhängig von äußerer Kontrolle der Signalweg konstitutiv aktiviert und liefert ein Wachstumssignal. Untersuchungen haben aber gezeigt, dass beim Vorliegen solcher Mutationen immer noch eine – unzureichende – Ubiquitinylierung und ein AbbauDer WNT-Signalweg ist ein hochkonservierter Signalweg, dessen zentraler intrazellulärer Regulationsschritt die Proteinstabilität des Proteins β-Catenin ist. Deregulierende Mutationen in diesem sind frühe Ereignisse bei der Entstehung von Darmtumoren. Ist der Abbau von β-Catenin gestört, so ist unabhängig von äußerer Kontrolle der Signalweg konstitutiv aktiviert und liefert ein Wachstumssignal. Untersuchungen haben aber gezeigt, dass beim Vorliegen solcher Mutationen immer noch eine – unzureichende – Ubiquitinylierung und ein Abbau von β-Catenin stattfindet. Ziel dieser Studie war Deubiquitinasen (DUBs) zu finden, die durch ihre Aktivität den Abbau von β-Catenin verhindern. Mithilfe eines siRNA Screens in der Vorarbeit konnten DUBs als Kandidaten für einen CRISPR Ansatz ausgewählt werden. APC Wildtyp HEK293T Zellen und Darmkrebszellen wurden mit lentiviralen CRISPR/Cas9 Vektoren infiziert, in welche sgRNAs gegen exonische Sequenzen von DUBs geklont waren. Einzelne Zellklone von USP10 CRISPR Zellen wurden weiter untersucht. In Western Blots und Immunofluoreszenz zeigte sich bei den USP10 CRISPR Zellen eine verminderte Expression von USP10 und damit einhergehend β-Catenin. Proteinstabilitätsversuche mit MG132 und Cycloheximid zeigten einen erhöhten Abbau von β-Catenin in HEK293T USP10 CRISPR Zellen, vor allem nach Stimulierung des WNT-Signalwegs durch LiCl. In Aktivierungsassays (Luciferase und TOP-GFP FACS) des WNT-Signalwegs zeigte sich in HEK293T Zellen nach Behandlung mit LiCl eine geringere Aktivierung in den USP10 CRISPR Zellen. In einem Wachstumsassay zeigten HT29 USP10 CRISPR ein geringeres Wachstum als Kontrollzellen. Während in einer histologischen Färbung von Mausgewebe eine erhöhte Expression von USP10 nachweisbar war, zeigten sich in einer TMA Färbung kein eindeutiger Unterschied zwischen gesundem Gewebe und Tumorgewebe. Die Studie identifiziert USP10 als eine mögliche DUB für β-Catenin und potenzielles Ziel für eine Beeinflussung des mutierten WNT-Signalwegs in Darmkrebszellen.show moreshow less
  • The WNT- signaling pathway is a highly preserved pathway. Its central intracellular regulation measure is the protein stability of the protein β-Catenin. Mutations that cause a deregulation in said pathway occur early within the development of intestinal tumors. If the breakdown of β-Catenin is impaired, the WNT- signaling pathway will get activated constitutively, providing growth signals, regardless of outer controls. Investigations have shown, that if such mutations exist there will still be a (insufficient) ubiquitinylation and aThe WNT- signaling pathway is a highly preserved pathway. Its central intracellular regulation measure is the protein stability of the protein β-Catenin. Mutations that cause a deregulation in said pathway occur early within the development of intestinal tumors. If the breakdown of β-Catenin is impaired, the WNT- signaling pathway will get activated constitutively, providing growth signals, regardless of outer controls. Investigations have shown, that if such mutations exist there will still be a (insufficient) ubiquitinylation and a breakdown of β-Catenin. It was the aim of this research to identify deubiquitinases (DUBs) whose activity prevent the breakdown of β-Catenin. It was possible to select DUBs as potential candidates for a CRISPR approach by using sIRNA Screens. APC Wildtype HEK293T cells and intestinal tumor cells where infected by lentiviral CRISPR/Cas9 vectors which contained sgRNAs clones that worked against exonic sequences of DUBs. Individual cell clones of USP10 CRISPR cells where further investigated. Within western blots and immunofluorescence USP10 CRISPR cells showed a reduced expression of USP10 and thus, β- Catenin. Protein stability trials using MG132 and cycloheximide showed an increased breakdown of β-Catenin in HEK293T USP10 CRISPR cells, especially in response to stimulation of the WNT- signaling pathway using LiCl. Within activation assays (Luciferase and TOP-GFP FACS) of the WNT- signaling pathway, a reduced activation in USP10 CRISPR cells after treatment with LiCl was shown within HEK293T cells. Within a growth assay HT29 USP10 CRISPR showed a reduced growth when compared to control cells. While there was evidence of an increased expression of USP10 within the histological coloration of mouse tissue, the TMA coloration did not show a significant difference between healthy tissue and tumor tissue. This study identified USP10 as a possible DUB for β- Catenin and as a possible target for the manipulation of the mutations that cause a deregulation within the WNT- signaling pathway in intestinal tumor cells.show moreshow less

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Metadaten
Author: Gabriel ChristmannGND
URN:urn:nbn:de:bvb:20-opus-272998
Document Type:Doctoral Thesis
Granting Institution:Universität Würzburg, Medizinische Fakultät
Faculties:Fakultät für Biologie
Referee:Prof. Dr. Alexander Buchberger, Prof. Dr. Armin Wiegering
Date of final exam:2022/04/25
Language:German
Year of Completion:2022
DOI:https://doi.org/10.25972/OPUS-27299
Sonstige beteiligte Institutionen:Lehrstuhl für Biochemie und molekulare Biologie
Dewey Decimal Classification:6 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften / 61 Medizin und Gesundheit / 612 Humanphysiologie
GND Keyword:Darmkrebs; Ubiquitin
Tag:Catenin; USP10
Release Date:2022/05/30
Licence (German):License LogoDeutsches Urheberrecht