Sabrina M. Scholz

• Trotz intensiver Forschung und des Global-Eradication-of-Malaria-Programms der WHO in den 1950er Jahren zählt Malaria neben AIDS und Tuberkulose auch heute immer noch zu den bedeutendsten Infektionskrankheiten weltweit. Aufgrund rasch zunehmender Resistenzentwicklung der Erreger gegen gängige Prophylaxe- sowie Therapiepräparate und dem Fehlen eines Impfstoffs sterben jährlich bis zu 3 Mio. Menschen an Malaria. Seit vor etwa 2 Jahrzehnten das wissenschaftliche Interesse an transmissionsblockierenden Vakzinen gegen den Malariaerreger erwachte,Trotz intensiver Forschung und des Global-Eradication-of-Malaria-Programms der WHO in den 1950er Jahren zählt Malaria neben AIDS und Tuberkulose auch heute immer noch zu den bedeutendsten Infektionskrankheiten weltweit. Aufgrund rasch zunehmender Resistenzentwicklung der Erreger gegen gängige Prophylaxe- sowie Therapiepräparate und dem Fehlen eines Impfstoffs sterben jährlich bis zu 3 Mio. Menschen an Malaria. Seit vor etwa 2 Jahrzehnten das wissenschaftliche Interesse an transmissionsblockierenden Vakzinen gegen den Malariaerreger erwachte, rückten sexualstadienspezifische Oberflächenproteine in den Fokus der Impfstoffforschung. Im Zuge der vollständigen Sequenzierung des P.-falciparum-Genoms wurde bei dem Screenen nach Genen, die multiple tier- oder bakterienähnliche, adhäsive, extrazelluläre Domänen kodieren, die PfCCp-Familie identifiziert. Ihre 6 Mitglieder besitzen eine bemerkenswerte Vielfalt an hoch konservierten, adhäsiven Modulen, die eine Beteiligung an Protein-Protein-, -Polysaccharid- oder -Lipid-Interaktionen vermuten lassen. Die Multiadhäsionsdomänenproteine wurden aufgrund des gemeinsamen LCCL-Moduls PfCCp1 bis PfCCp5 benannt. Dem sechsten Mitglied, PfFNPA, fehlt zwar die namensgebende Domäne, doch die ausgeprägte Ähnlichkeit zu PfCCp5 führte zur Integration des Proteins in die PfCCp-Familie. Die Charakterisierung der ersten 3 Mitglieder zeigte, dass PfCCp1, PfCCp2 und PfCCp3 sexualstadienspezifisch exprimiert werden und in der parasitophoren Vakuole reifer Gametozyten lokalisiert sind. Immunfluoreszenzstudien ließen außerdem erkennen, dass die Proteine während der Gametenbildung partiell freigesetzt werden und in einer matrix-ähnlichen Struktur Exflagellationszentren umgeben. In KO-Studien erwiesen sich PfCCp2 und PfCCp3 zusätzlich als essentielle Faktoren für die Migration reifer Sporozoiten aus den Mitteldarmoozysten in die Speicheldrüsen der Mücken. Damit erfüllen sie die 2 grundlegenden Kriterien für Komponenten transmissionsblockierender Vakzine: eine sexual-stadienspezifische Expression und essentielle Funktion während der Parasitenentwicklung in der Mücke. Aufgrund dieser viel versprechenden Daten wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit die Analyse der PfCCp-Familie durch funktionale Charakterisierung von PfCCp4 sowie Interaktionsstudien an den PfCCp-Proteinen fortgesetzt. Die Expressionsanalysen mittels RT-PCR, Western Blot und Immunfluoreszenzstudien ergaben für PfCCp4 ebenfalls eine sexualstadienspezifische, Plasmamembran-assoziierte Expression innerhalb der parasitophoren Vakuole reifer Gametozyten. Die Expression beginnt bereits in Gametozyten des Stadium I und erfolgt hauptsächlich in Makrogametozyten. Im Gegensatz zu PfCCp1, PfCCp2 und PfCCp3 wird PfCCp4 jedoch homogen verteilt exprimiert. Während der Gametogenese wird PfCCp4 nicht freigesetzt, sondern verbleibt an der Oberfläche von Makrogameten. Es ist zudem das einzige Mitglied der PfCCp-Familie, dessen Expression im Zuge der Ookinetenreifung wieder aufgenommen wird. KO-Studien durch Membranfütterungen von Anopheles-Mücken lassen allerdings darauf schließen, dass PfCCp4 keine essentielle Funktion bei der Parasitenentwicklung ausübt. Der Verlust von PfCCp4 beeinträchtigte weder die Fertilisation noch die Bildung, Reifung oder Migration von Ookineten, Oozysten oder Sporozoiten. PfCCp4 kann somit nicht als Kandidat transmissionsblockierender Vakzine betrachtet werden, obwohl es mit den viel versprechenden Kandidaten Pfs230 und Pfs48/45 interagiert, wie funktionelle Analysen nativer PfCCp-Proteine mittels Ko-Immunpräzipitation ergaben. Weitere Ko-Immunpräzipitationsstudien identifizierten Interaktionen innerhalb der PfCCp-Familie, wie bereits die Ko-Lokalisation und ko-abhängige Expression von PfCCp1, PfCCp2 und PfCCp3, ihre Freisetzung bei der Gametogenese und die matrixähnliche Verteilung um Exflagellationszentren vermuten ließen. In Affinitätschromatographiestudien unter Verwendung rekombinanter PfCCp-Proteine konnte gezeigt werden, dass es sich dabei um direkte Interaktionen handelt, an denen besonders die LCCL- und die SR-Domäne beteiligt zu sein scheinen. In Zelladhäsionsstudien konnte außerdem eine Bindungsaffinität ausgewählter rekombinanter PfCCp-Proteine an Makrogameten beobachtet werden. Insgesamt bestätigen diese Daten unsere Hypothese, dass PfCCp-Proteine unter Beteiligung weiterer sexualstadienspezifischer Proteine während der Gametozytenreifung und Gametogenese Proteinkomplexe ausbilden. In zukünftigen Studien gilt es einerseits, ausgewählte PfCCp-Proteine durch transmissionsblockierende Experimente in ihrem Potential als Impfstoffkomponenten zu evaluieren. Andererseits nimmt die funktionale Charakterisierung der Proteinkomplexe während der Gamogonie eine zentrale Rolle ein, um ihre Funktion in der Sexualphase von P. falciparum zu klären und die Beteiligung der PfCCp-Proteine an der Regulation dieses komplexen Lebenszyklus zu verstehen.…
• Despite intense research and the global eradication of malaria program of the WHO in the 1950’s, malaria is among AIDS and tuberculosis still one of the major infectious diseases worldwide. Rapidly increasing resistance of the pathogen against common treatment, and the persistent lack of a vaccine against malaria lead to a death toll of up to three million people annually. Since the scientific interest in transmission blocking strategies against P. falciparum awoke two decades ago, sexual stage-specific surface proteins became an importantDespite intense research and the global eradication of malaria program of the WHO in the 1950’s, malaria is among AIDS and tuberculosis still one of the major infectious diseases worldwide. Rapidly increasing resistance of the pathogen against common treatment, and the persistent lack of a vaccine against malaria lead to a death toll of up to three million people annually. Since the scientific interest in transmission blocking strategies against P. falciparum awoke two decades ago, sexual stage-specific surface proteins became an important focus of antimalarial vaccine research. Especially, proteins containing multiple adhesion domains are regarded as promising candidates for subunits of transmission blocking vaccines due to their possible involvement in parasite-parasite or parasite-host interactions. Following the completion of the P. falciparum genome sequence and its screening for multiple animal- or bacterial-like, extracellular adhesion domains, the PfCCp protein family had been identified. It consists of six members with a striking variety of highly conserved adhesive modules, which were predicted to be involved in protein-protein, protein-polysaccharide or protein-lipid binding. These multidomain adhesion proteins were named PfCCp1 through PfCCp5 due to their common LCCL-domain. Though PfFNPA, the sixth member, lacks this domain, its strong similarity to the PfCCp5 architecture warranted its integration into the PfCCp family. The characterization of the first three family members showed, that PfCCp1, PfCCp2 and PfCCp3 are specifically expressed within the parasitophorous vacuole of mature gameto-cytes. Studies via immunofluorescence assays revealed, that they are partly released during emergence and surround exflagellation centers extracellularly in a matrix-like pattern. Moreover, PfCCp2 and PfCCp3 were shown in knockout experiments to be essential for the transition of sporozoites from the midgut oocysts to the salivary glands of the mosquito. Thus, they fulfil two basic criteria for prospective components of transmission blocking vaccines: sexual stage-specific expression and an essential role for the parasite development within the mosquito. Based upon this promising data the present thesis dealt with further analyses of the PfCCp family via functional characterization of PfCCp4 and interaction studies of the PfCCp proteins. The expression analysis of PfCCp4 using RT-PCR, Western Blot and immunofluorescence assays showed that it is also expressed in association with the plasma membrane within the parasitophorous vacuole of mature gametocytes. Expression starts as early as stage I of gametocytogenesis and is mainly restricted to macrogametocytes. In contrast to PfCCp1, PfCCp2 and PfCCp3, PfCCp4 is not expressed in a punctuated pattern but is distributed homogenously, and instead of being released during emergence it remains on the surface of macrogametes. In addition, PfCCp4 is the only PfCCp member that resumes expression during ookinete maturation. Knockout experiments revealed in membrane feedings of Anopheles mosquitoes that PfCCp4 plays no essential role in the parasite development. The lack of PfCCp4 neither affected fertilization nor formation, maturation or migration of ookinetes, oocysts or sporozoites. Thus, PfCCp4 does not display any potential as a candidate for transmission blocking vaccines, though it interacts with the promising candidates Pfs230 and Pfs48/45, as functional characterizations of native PfCCp proteins showed via co-immunoprecipitation assays. Further co-immunoprecipitation experiments revealed protein-protein interactions within the PfCCp family, as the co-localization data had suggested, supported by the co-dependent expression of PfCCp1, PfCCp2 and PfCCp3, their release during emergence and their matrix-like surrounding of exflagellation centers. Affinitychromatography studies on recombi-nant PfCCp proteins demonstrated, that these interactions are direct interactions, which appear to be mediated predominantly by the LCCL- and SR-domains. Cell adhesion assays revealed in addition a prominent binding affinity of select recombinant PfCCp proteins to macrogametes. Taken together, this data support our hypothesis of protein complex formation mediated by the members of the PfCCp family and other sexual stage-specific proteins during the sexual development of P. falciparum. Future studies aim on one hand at the evaluation of the potential of select PfCCp proteins as vaccine subunits by transmission blocking assays. On the other hand, another focus will be the characterization of the proposed protein complexes to gain deeper insight into their function during sexual development, and to understand the role of the PfCCp proteins in the regulation of the intricate life cycle of the human malaria pathogen P. falciparum.…