Patricia Bach

• Transmissible spongiform encephalopathies (TSEs) or prion diseases are a group of infectious neurodegenerative diseases that are associated with misfolding of the cellular form of the cellular prion protein (PrPC) into a disease associated conformer (PrPSc). No therapy for prion diseases is available at present. So far, anti-PrPC vaccination is hampered by immunological tolerance of the mammalian immune system to endogenous PrPC. The aim of this thesis was to set up a new vaccination strategy based on virus-like particles (VLP) to induceTransmissible spongiform encephalopathies (TSEs) or prion diseases are a group of infectious neurodegenerative diseases that are associated with misfolding of the cellular form of the cellular prion protein (PrPC) into a disease associated conformer (PrPSc). No therapy for prion diseases is available at present. So far, anti-PrPC vaccination is hampered by immunological tolerance of the mammalian immune system to endogenous PrPC. The aim of this thesis was to set up a new vaccination strategy based on virus-like particles (VLP) to induce anti-PrPC antibody responses in PrPC-competent mice. In a first step it was assessed whether VLP have the capacity to induce antibody responses that are protective against conventional pathogens. For this purpose, VLP displaying the vesicular stomatitis virus-gylcoprotein (VLP-VSV) were generated and tested for their immunogenicity. Similarly to live vesicular stomatitis virus (VSV), replication deficient VLP-VSV induced T help-independent VSV neutralizing IgM responses that switched to the IgG subclass in a T help-dependent manner. Furthermore, type I IFN receptor (IFNAR) triggering only marginally affected VLP-VSV induced neutralizing IgM responses, whereas it was critically required to promote the IgG switch. The analysis of conditional knockout mice with a lymphocyte-specific IFNAR deletion revealed that IFNAR triggering of lymphocytes did not play a crucial role, neither upon VLP-VSV nor VSV immunization. Collectively, these data verified the high immunogenicity of VLP. Therefore, in a next step VLP were generated displaying the C-terminal half of PrP (residues 121-231aa) fused to the platelet derived growth factor receptor (PDGFR) transmembrane region (VLP-PrPD111) for anti-PrPC immunization. On the surface of such retroparticles, PrPC was expressed at high levels as determined by electron microscopy. VLP-PrPD111 immunization of Prnp-deficient (Prnp0/0) mice resulted in antibody response specifically binding the cellular form of PrPC. Upon intravenous injection of wild-type mice, high PrPC-specific IgM responses were induced, whereas the T cell-dependent switch from the IgM to the IgG subclass was less pronounced. As a consequence, anti-PrPC titers were rather short-lived. The impaired subclass switch was probably related with host T cell tolerance to endogenous PrPC. Attempts to increase anti-PrPC IgG responses in wild-type mice via administration of VLP-PrPD111 emulsified in various different adjuvants failed. Nevertheless, in single individuals low IgG antibodies were induced after immunization of VLP-PrPD111 emulsified in CFA. To circumvent T cell tolerance in wild-type mice, a multitude of different immunization strategies was tested, including priming and boosting protocols with different types of VLP or VLP expressing PrPC together with foreign T helper epitopes. Overall, those efforts did not improve anti-PrPC IgG responses in wild-type mice. Interestingly, anti-PrPC antibodies induced in Prnp0/0 mice reduced PrPSc levels in prion infected cell cultures, whereas serum of vaccinated wild-type mice did not. To assess the protective capacity of VLP-PrPD111 induced immune responses, vaccinated wild-type mice were infected with scrapie (RML 5.0). Unfortunately, vaccinated mice did not show a significant delay in the onset of scrapie. In a last part of the thesis it was studied whether in the absence of T cell help activated “memory” B cells were able to produce anti-PrPC specific antibodies. To address this question, PrPC-specific memory B cells were sorted from vaccinated Prnp0/0 mice and adoptively transferred into wild-type recipient mice. Upon VLP-PrPD111 challenge, no PrPC-specific IgG titers were induced in the recipients. Nevertheless, several VLP-PrPD111 challenged recipient mice were protected against scrapie infection. In conclusion, VLP were characterized as highly immunogenic vaccines that were used to elucidate various questions concerning adaptive immune response and basic mechanisms of PrPC-specific tolerance vs. immunity. Remarkably, VLP-PrPD111 was able to induce native PrPC-specific antibodies in wild-type mice but major difficulties associated with PrPC-specific tolerance made efficacious scrapie vaccination impossible. New vaccination approaches are being tested to overcome these limitations.…
• Prionkrankheiten sind tödlich verlaufende neurodegenerative Erkrankungen des zentralen Nervensystems. Der Erreger ist das infektiöse pathologisch gefaltete Prionen Protein PrPSc, welches durch Umfaltung des zellulären ubiquitär exprimierten Prionen Proteins PrPC entsteht. Bis heute existieren keine erfolgreichen Therapiemöglichkeiten für Prionkrankheiten. Aus unterschiedlichen Zellkulturstudien ist jedoch bekannt, dass Antikörper, die gegen das zelluläre PrPC gerichtet sind, eine PrPSc Ausbreitung verhindern können. Weiterhin zeigenPrionkrankheiten sind tödlich verlaufende neurodegenerative Erkrankungen des zentralen Nervensystems. Der Erreger ist das infektiöse pathologisch gefaltete Prionen Protein PrPSc, welches durch Umfaltung des zellulären ubiquitär exprimierten Prionen Proteins PrPC entsteht. Bis heute existieren keine erfolgreichen Therapiemöglichkeiten für Prionkrankheiten. Aus unterschiedlichen Zellkulturstudien ist jedoch bekannt, dass Antikörper, die gegen das zelluläre PrPC gerichtet sind, eine PrPSc Ausbreitung verhindern können. Weiterhin zeigen Infektionsstudien in Mäusen, in denen passive Immunisierungen mit PrPC-spezifischen Antikörpern vorgenommen wurden, eine Verlängerung der Inkubationszeit bis zum Ausbruch der Erkrankung. In dieser Arbeit sollte untersucht werden, ob es möglich ist, durch eine aktive Immunisierung mit Virus-ähnlichen Partikeln (VLP) anti-PrPC spezifische Antikörperantworten zu induzieren, die gegen Prionkrankheiten Schutz vermitteln können. Dazu wurde zuerst die Immunogenität von VLP bestimmt, um anschließend PrPC exprimierende VLP als Antigene für PrP-Immunisierungen zu entwickeln. Im ersten Teil dieser Arbeit wurden replikationsdefiziente VLP, die als fremdes Protein das Vesikuläre Stomatitis Virus Glykoprotein auf der Oberfläche exprimieren, hergestellt (VLP-VSV). VLP-VSV immunisierte Mäuse zeigten analog zu VSV infizierten Tieren T-Zell Hilfe unabhängige neutralisierende IgM Antikörperantworten und einen T-Zell Hilfe abhängigen Subklassenwechsel nach IgG. Interessanterweise ist nach VLP-VSV Immunisierung die frühe Induktion von neutralisierenden IgM Antikörpern unabhängig vom Typ I Interferon Rezeptor (IFNAR) Signalweg. Dagegen wird für den Subklassenwechsel nach IgG der IFNAR-Signalweg benötigt. Mäuse mit einer lymphozytenspezifischen IFNAR-Deletion zeigten nach VLP-VSV oder VSV Infektion IgM und IgG Antikörperantworten gegen VSV. Diese Beobachtungen zeigten, dass der Signalweg über den IFNAR auf Lymphozyten keine entscheidende Rolle bei der Induktion von VSV-neutralisierenden IgG Antikörpern spielte. Zusammenfassend ergab sich aus den Daten, dass VLP-VSV Retropartikel starke Immunogene sind, geeignet um schützende Immunantworten gegen ein Modellvirus zu induzieren. Im zweiten Teil der Arbeit wurden PrPC exprimierende VLP hergestellt. Da der C-terminale Teil des Prionenproteins eine wichtige Rolle bei der Umfaltung von PrPC nach PrPSc spielt, wurde die distale Domäne (Aminosäure 121-231) auf der Oberfläche von VLP exprimiert (VLP-PrPD111). Die erfolgreiche Inkorporation von PrP111 auf VLP konnte mittels Elektronenmikroskopie gezeigt werden. Im nächsten Schritt wurden PrP-defiziente (Prnp0/0) Mäuse mit VLP-PrPD111 immunisiert und auf PrPC-spezifischen Antikörperantworten untersucht. Tatsächlich induzierte die Immunisierung mit VLP-PrPD111 starke Antikörperantworten mit hohen IgG Serum-Titern, die spezifisch die native Form des Prionen Proteins erkannten. Nach VLP-PrPD111 Immunisierung von Wildtyp Mäusen wurde eine Induktion von frühen IgM Antikörperantworten beobachtet, der Subklassenwechsel nach IgG erfolgte jedoch nur sehr schwach. Die induzierten IgG Antikörper zeigten eine geringe Affinität zu PrP und waren nicht lange im Serum nachweisbar. Eine mögliche Ursache hierfür ist die PrPC-spezifische T-Zell Toleranz. Die Zugabe von unterschiedlichen Adjuvanzien zu VLP-PrPD111 verbesserte die IgG Antwort nicht. Als Ausnahme konnte in einzelnen Wildtyp Mäusen nach Immunisierung mit VLP-PrPD111 in „complete Freund´s Adjvant“ (CFA) IgG Antikörper detektiert werden, die bis zu 144 Tage nach der Immunisierung im Serum wiederzufinden waren. Zu einem späteren Zeitpunkt waren diese PrPC-spezifischen Antikörper jedoch nicht mehr detektierbar. Um die T-Zell Toleranz zu umgehen, wurden im nächsten Schritt unterschiedliche Retropartikel in verschiedenen Immunisierungsstrategien getestet. Im Einzelnen wurden verschiedene Typen von PrP-exprimierende HIV oder MLV Retropartikel in Primär- und Sekundärimmunisierungen eingesetzt oder VLP hergestellt, die zusätzlich zum Prion-Protein das VSV-G Protein als fremdes T-Helfer Epitop auf der Oberfläche exprimierten. Mit Hilfe dieser Immunisierungsansätze konnten jedoch keine verstärkten IgG Antikörperantworten in Wildtyp Mäusen erzielt werden. In Zellkultur konnten die in Prnp0/0 Mäusen induzierten PrPC-spezifischen Antikörper den PrPSc-Gehalt in Prion-infizierten Zellen reduzieren. Die Seren der VLP-PrPD111 immunisierten Wildtyp Mäuse zeigten jedoch keinen Schutzeffekt. Im Weiteren wurde getestet, ob VLP-PrPD111 immunisierte Wildtyp Mäuse nach Inokulation eines Maus-adaptierten Scrapiestammes (RML 5.0) geschützt sind. Die VLP-PrPD111 immunisierten Mäuse erkrankten jedoch im gleichen Zeitraum wie nicht immunisierte Kontrolltiere. Der letzte Teil dieser Arbeit beschäftigte sich mit der Frage, ob nach adoptivem Transfer von Prnp0/0 B-Gedächtniszellen in Wildtyp Rezipienten eine Steigerung der PrPC-spezifischen Immunantwort in Abwesenheit von T-Zellhilfe erzielt werden kann. Dazu wurden aus VLP-PrPD111 immunisierten Prnp0/0 Mäusen B-Zellen isoliert und adoptiv in Wildtyp Rezipienten transferiert. Nach VLP-PrPD111-Immunisierung der Wildtyp Rezipienten konnten keine erhöhten IgG Antikörper Titer beobachtet werden. Trotzdem waren einzelne Wildtyp Mäuse nach PrPSc Inokulation gegen Scrapie geschützt. Zusammenfassend wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass VLP-PrPD111 sehr gute Antigene sind, die durchaus eine Umgehung der PrP-spezifischen Toleranz erlauben. Im Vergleich zu anderen bisher beschriebenen PrP-spezifischen Antikörperantworten, die nach Immunisierung vorzugsweise lineare Epitope erkennen, induzierten VLP-PrPD111 Autoantikörperantworten, die gegen das native PrPC Protein gerichtet sind. Schwierigkeiten bezüglich aktiver PrP-Immunisierungen liegen jedoch in der verbleibenden T-Zell Toleranz gegenüber PrPC.…