Christina Popp

• Infections with the opportunistic yeast Candida albicans are frequently treated with the first-line drug fluconazole, which inhibits ergosterol biosynthesis. An alarming problem in clinics is the development of resistances against this azole, especially during long-term treatment of patients. Well-known resistance mechanisms include mutations in the zinc cluster transcription factors (ZnTFs) Mrr1 and Tac1, which cause an overexpression of efflux pump genes, and Upc2, which results in an overexpression of the drug target. C. albicans strainsInfections with the opportunistic yeast Candida albicans are frequently treated with the first-line drug fluconazole, which inhibits ergosterol biosynthesis. An alarming problem in clinics is the development of resistances against this azole, especially during long-term treatment of patients. Well-known resistance mechanisms include mutations in the zinc cluster transcription factors (ZnTFs) Mrr1 and Tac1, which cause an overexpression of efflux pump genes, and Upc2, which results in an overexpression of the drug target. C. albicans strains with such gain-of-function mutations (GOF) have an increased drug resistance conferring a selective advantage in the presence of the drug. It was previously shown that this advantage comes with a fitness defect in the absence of the drug. This was observed in different conditions and is presumably caused by a deregulated gene expression. One aim of the present study was to examine whether C. albicans can overcome the costs of drug resistance by further evolution. Therefore, the relative fitness of clinical isolates with one or a combination of different resistance mutations in Mrr1, Tac1 and/or Upc2 was analyzed in competition with the matched fluconazole-susceptible partner. Most fluconazole-resistant isolates had a decreased fitness in competition with their susceptible partner in vitro in rich medium. In contrast, three fluconazole-resistant strains with Mrr1 resistance mutations did not show a fitness defect in competition with their susceptible partner. In addition, the fitness of four selected clinical isolate pairs was examined in vivo in mouse models of gastrointestinal colonization (GI) and disseminated infection (IV). In the GI model all four fluconazole-resistant strains were outcompeted by their respective susceptible partner. In contrast, in the IV model only one out of four fluconazole-resistant isolates did show a slight fitness defect in competition with its susceptible partner during infection of the kidneys. It can be stated, that in the present work the in vitro fitness did not reflect the in vivo fitness and that the overall fitness was dependent on the tested conditions. In conclusion, C. albicans cannot easily overcome the costs of drug resistance caused by a deregulated gene expression. In addition to GOFs in Mrr1, Tac1 and Upc2, resistance mutations in the drug target Erg11 are a further key fluconazole resistance mechanism of C. albicans. Clinical isolates often harbor several resistance mechanisms, as the fluconazole resistance level is further increased in strains with a combination of different resistance mutations. In this regard, the question arises of how strains with multiple resistance mechanisms evolve. One possibility is that strains acquire mutations successively. In the present study it was examined whether highly drug-resistant C. albicans strains with multiple resistance mechanisms can evolve by parasexual recombination as another possibility. In a clonal population, cells with individually acquired resistance mutations could combine these advantageous traits by mating. Thereupon selection could act on the mating progeny resulting in even better adapted derivatives. Therefore, strains heterozygous for a resistance mutation and the mating type locus (MTL) were grown in the presence of fluconazole. Derivatives were isolated, which had become homozygous for the resistance mutation and at the same time for the MTL. This loss of heterozygosity was accompanied by increased drug resistance. In general, strains which are homozygous for one of both MTL configurations (MTLa and MTLα) can switch to the opaque phenotype, which is the mating-competent form of the yeast, and mate with cells of the opposite MTL. In the following, MTLa and MTLα homozygous strains in the opaque phenotype were mated in all possible combinations. The resulting mating products with combined genetic material from both parents did not show an increased drug resistance. Selected products of each mating cross were passaged with stepwise increasing concentrations of fluconazole. The isolated progeny showed high levels of drug resistance and loss of wild-type alleles of resistance-associated genes. In conclusion, selective pressure caused by fluconazole exposure selects for resistance mutations and at the same time induces genomic rearrangements, resulting in mating competence. Therefore, in a clonal population, cells with individually acquired resistance mutations can mate with each other and generate mating products with combined genetic backgrounds. Selection can act on these mating products and highly drug-resistant und thus highly adapted derivatives can evolve as a result. In summary, the present study contributes to the current understanding of the evolution of antifungal drug resistance by elucidating the effect of resistance mutations on the fitness of the strains in the absence of the drug selection pressure and investigates how highly drug-resistant strains could evolve within a mammalian host.…
• Infektionen mit dem opportunistischen Hefepilz Candida albicans werden häufig mit dem First-Line-Medikament Fluconazol behandelt, welches die Ergosterol-Biosynthese hemmt. Ein besorgniserregendes Problem in der Klinik, insbesondere bei der Langzeitbehandlung von Patienten, ist die Entwicklung von Resistenzen gegen dieses Azol. Zu den bekannten Resistenzmechanismen gehören Resistenzmutationen in den Zink-Cluster-Transkriptionsfaktoren (ZnTFs) Mrr1 und Tac1, die eine Überexpression von Effluxpumpen-Genen bewirken und Resistenzmutationen in Upc2,Infektionen mit dem opportunistischen Hefepilz Candida albicans werden häufig mit dem First-Line-Medikament Fluconazol behandelt, welches die Ergosterol-Biosynthese hemmt. Ein besorgniserregendes Problem in der Klinik, insbesondere bei der Langzeitbehandlung von Patienten, ist die Entwicklung von Resistenzen gegen dieses Azol. Zu den bekannten Resistenzmechanismen gehören Resistenzmutationen in den Zink-Cluster-Transkriptionsfaktoren (ZnTFs) Mrr1 und Tac1, die eine Überexpression von Effluxpumpen-Genen bewirken und Resistenzmutationen in Upc2, die zu einer Überexpression des Wirkstofftargets führen. C. albicans Stämme mit solchen Gain-of-Function-Mutationen (GOF) weisen eine erhöhte Medikamentenresistenz auf, was einen selektiven Vorteil in Gegenwart des Medikaments bedeutet. Es wurde zuvor gezeigt, dass dieser Vorteil mit einem Fitnessdefekt in Abwesenheit des Medikaments einhergeht. Dies wurde in verschiedenen Bedingungen nachgewiesen und wird vermutlich durch eine deregulierte Genexpression verursacht. Ein Ziel der vorliegenden Studie war es zu untersuchen, ob C. albicans die Kosten der Medikamentenresistenz durch Evolution kompensieren kann. Daher wurde die relative Fitness von klinischen Isolaten mit einer oder einer Kombination verschiedener Resistenzmutationen in Mrr1, Tac1 und/oder Upc2 im Wettbewerb mit dem zugehörigen Fluconazol-sensitiven Partner analysiert. Die meisten Fluconazol-resistenten Isolate hatten eine verminderte Fitness im Wettbewerb mit ihrem sensitiven Partner in vitro in vollwertigem Medium. Dennoch zeigten drei Fluconazol-resistente Stämme mit Mrr1-Resistenzmutationen keinen Fitnessdefekt im Wettbewerb mit ihrem jeweiligen Partner. Zusätzlich wurde die Fitness von vier ausgewählten klinischen Isolat-Paaren in vivo in Mausmodellen für gastrointestinale Kolonisation (GI) und disseminierte Infektion (IV) untersucht. Im GI-Modell wurden alle vier Fluconazol-resistenten Stämme von ihren sensitiven Partnern überwachsen. Im Gegensatz dazu zeigte im IV-Modell nur einer der vier Fluconazol-resistenten Isolate einen leichten Fitnessdefekt im Wettbewerb mit dem jeweiligen Fluconazol-sensitiven Partner während der Infektion der Nieren. Es kann festgestellt werden, dass in der vorliegenden Arbeit die in vitro-Fitness nicht die in vivo-Fitness widerspiegelt und dass die Gesamtfitness von den getesteten Bedingungen abhängig ist. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass C. albicans die Kosten der Medikamentenresistenz, die durch eine deregulierte Genexpression verursacht werden, nur schwer überwinden kann. Neben GOFs in Mrr1, Tac1 und Upc2 sind Resistenzmutationen im Wirkstofftarget Erg11 ein wichtiger Resistenzmechanismus von C. albicans. Klinische Isolate weißen oft mehrere Resistenzmechanismen auf, da die Kombination verschiedener Resistenzmutationen die Fluconazol-Resistenz potenziert. In diesem Zusammenhang stellt sich die Frage, wie sich Stämme mit mehreren Resistenzmechanismen entwickeln. Eine Möglichkeit ist, dass Stämme Mutationen sequenziell erwerben. In der vorliegenden Studie wurde untersucht, ob als weitere Möglichkeit hochresistente C. albicans Stämme mit multiplen Resistenzmechanismen durch parasexuelle Rekombination evolvieren können. In einer klonalen Population könnten Zellen mit individuell erworbenen Resistenzmutationen diese vorteilhaften Eigenschaften durch Paarung kombinieren. Daraufhin könnte Selektionsdruck auf die Matingprodukte wirken und so die Entstehung von besser angepassten Derivaten begünstigen. Daher wurden Resistenzmutation und Mating Type Locus (MTL) heterozygote Stämme in Gegenwart von Fluconazol kultiviert. So konnten Derivate isoliert werden, die homozygot für die Resistenzmutation und gleichzeitig für den MTL geworden waren. Dieser Verlust der Heterozygotie ging mit einer erhöhten Medikamentenresistenz einher. Generell können Stämme, die homozygot für eine der beiden MTL-Konfigurationen (MTLa und MTLα) sind, in den opaque Phänotyp wechseln, der die paarungskompetente Form der Hefe darstellt, und sich mit Zellen des gegensätzlichen MTL paaren. Im Folgenden wurden MTLa und MTLα homozygote Stämme im opaque Phänotyp in allen möglichen Kombinationen verpaart. Die resultierenden Matingprodukte mit kombiniertem genetischem Material beider Elternteile wiesen keine erhöhte Medikamentenresistenz auf. Ausgewählte Paarungsprodukte jeder Kreuzung wurden mit stufenweise ansteigenden Konzentrationen von Fluconazol passagiert. Die isolierten Nachkommen zeigten ein hohes Maß an Medikamentenresistenz und den Verlust von Wildtyp-Allelen der resistenzassoziierten Gene. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der selektive Druck, der durch die Fluconazol-Exposition verursacht wird, für Resistenzmutationen selektiert und gleichzeitig genomische Umlagerungen induziert, die eine Paarung ermöglichen. Daher können sich in einer klonalen Population Zellen mit individuell erworbenen Resistenzmutationen miteinander paaren und Matingprodukte mit kombiniertem genetischem Hintergrund generieren. Auf diese Matingprodukte kann die Selektion wirken, woraufhin sich hochresistente und damit stark an ihre Umwelt angepasste Derivate entwickeln können. Zusammenfassend trägt die vorliegende Studie zum aktuellen Verständnis der Evolution der Antimykotika-Resistenz bei, indem sie den Effekt von Resistenzmutationen auf die Fitness der Stämme in Abwesenheit des Medikamenten-Selektionsdrucks untersucht und aufklärt, wie sich hochgradig resistente Stämme in einem Säugetierwirt entwickeln könnten.…