Steffen Altrichter

• The superfamily of G protein-coupled receptors (GPCRs) comprises more than 800 members, which are divided into five families based on phylogenetic analyses (GRAFS classification): Glutamate, Rhodopsin, Adhesion, Frizzled/Taste2 and Secretin. The adhesion G protein-coupled receptor (aGPCR) family forms with 33 homologs in Mammalia the second largest and least investigated family of GPCRs. The general architecture of an aGPCR comprises the GPCR characteristics of an extracellular region (ECR), a seven transmembrane (7TM) domain and anThe superfamily of G protein-coupled receptors (GPCRs) comprises more than 800 members, which are divided into five families based on phylogenetic analyses (GRAFS classification): Glutamate, Rhodopsin, Adhesion, Frizzled/Taste2 and Secretin. The adhesion G protein-coupled receptor (aGPCR) family forms with 33 homologs in Mammalia the second largest and least investigated family of GPCRs. The general architecture of an aGPCR comprises the GPCR characteristics of an extracellular region (ECR), a seven transmembrane (7TM) domain and an intracellular region (ICR). A special feature of aGPCRs is the extraordinary size of the ECR through which they interact with cellular and matricellular ligands via adhesion motif folds. In addition, the ECR contains a so-called GPCR autoproteolysis-inducing (GAIN) domain, which catalyzes autoproteolytic cleavage of the protein during maturation. This cleavage leads to the formation of an N-terminal (NTF) and a C-terminal fragment (CTF), which build a unit by means of hydrophobic interactions and therefore appear as a heterodimeric receptor at the cell surface. In the past, it has been shown that the first few amino acids of the CTF act as a tethered agonist (TA) that mediates the activation of the receptor through the interaction with the 7TM domain. However, the molecular mechanism promoting the TA-7TM domain interaction remains elusive. This work reveals a novel molecular mechanism that does not require the dissociation of the NTF-CTF complex to promote release of the TA and thus activation of the aGPCR. The introduction of bioorthogonal labels into receptorsignaling- relevant regions of the TA of various aGPCRs demonstrated that the TA is freely accessible within the intact GAIN domain. This suggests a structural flexibility of the GAIN domain, which allows a receptor activation independent of the NTF-CTF dissociation, as found in cleavage-deficient aGPCR variants. Furthermore, the present study shows that the cellular localization and the conformation of the 7TM domain depends on the activity state of the aGPCR, which in turn indicates that the TA mediates conformational changes through the interaction with the 7TM domain, which ultimately regulates the receptor activity. In addition, biochemical analyses showed that the GAIN domain-mediated autoproteolysis of the human aGPCR CD97 (ADGRE5/E5) promotes further cleavage events within the receptor. This suggests that aGPCRs undergo cleavage cascades, which are initialized by the autoproteolytic reaction of the GAIN domain. Thus, it can be assumed that aGPCRs are subject to additional proteolytic events. Finally, the constitutive internalization of the NTF and the CTF of E5 was demonstrated by various labeling methods. It was possible to label both fragments independently and to follow their subcellular location in vitro. In summary, these obtained results contribute to a better understanding about the molecular mechanisms of activity and signaling of aGPCRs.…
• Die Superfamilie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) umfasst weit mehr als 800 Mitglieder, welche aufgrund von phylogenetischen Analysen in fünf Familien unterteilt werden (GRAFS Klassifizierung): Glutamat, Rhodopsin, Adhäsion, Frizzled/Taste2 und Sekretin. Die Familie der Ädhesions-G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (aGPCRs) bildet mit 33 Homologen in Säugetieren die zweitgrößte Familie innerhalb der GPCRs. Die generelle Architektur eines aGPCRs weist die GPCR typischen Merkmale einer extrazellulären Region (ECR), einerDie Superfamilie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) umfasst weit mehr als 800 Mitglieder, welche aufgrund von phylogenetischen Analysen in fünf Familien unterteilt werden (GRAFS Klassifizierung): Glutamat, Rhodopsin, Adhäsion, Frizzled/Taste2 und Sekretin. Die Familie der Ädhesions-G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (aGPCRs) bildet mit 33 Homologen in Säugetieren die zweitgrößte Familie innerhalb der GPCRs. Die generelle Architektur eines aGPCRs weist die GPCR typischen Merkmale einer extrazellulären Region (ECR), einer sieben Transmembrandomäne (7TM) und einer intrazellulären Region (ICR) auf. Eine Besonderheit stellt hierbei die außergewöhnliche Größe der ECR, welche über vielfältige Domänen mit zellulären und matrixgebundenen Liganden interagieren, dar. Zusätzlich umfasst die ECR eine sogenannte GPCR Autoproteolyse-induzierende (GAIN) Domäne, an welcher während der Proteinreifung eine autoproteolytische Spaltung stattfindet. Diese Spaltung führt zur Entstehung eines N-terminalen (NTF) und C-terminalen Fragmentes (CTF), welche mittels hydrophober Wechselwirkung eine Einheit an der Zelloberfläche und daher einen heterodimeren Rezeptor bilden. In der Vergangenheit zeigte sich, dass die ersten paar Aminosäuren des CTF als angebundener Agonist (TA) agieren und über die Interaktion mit der 7TM Domäne eine Aktivierung des Rezeptors vermitteln. Der molekulare Mechanismus, welcher die Wechselwirkung zwischen TA und 7TM Domänen fördert, ist jedoch weiterhin unbekannt. Diese Arbeit enthüllt einen neuartigen molekularen Mechanismus, welcher keine Dissoziation des NTF-CTF Komplexes benötigt, um eine Freisetzung des TA und damit eine Aktivierung des aGPCR zu gewährleisten. Mittels der Einbringung von bioorthogonalen Markierungen in rezeptorsignalisierungs-relevante Bereiche des TA von diversen aGPCRs, wurde gezeigt, dass dieser innerhalb der intakten GAIN Domäne freizugänglich vorliegt. Dies lässt auf eine strukturelle Flexibilität der GAIN Domäne schließen, welche eine Rezeptoraktivierung unabhängig von der NTF-CTF Dissoziation erlaubt, wie sie auch bei spaltungsdefizienten aGPCR Varianten vorzufinden ist. Des Weiteren zeigt die vorliegende Arbeit, dass sich die zelluläre Lokalisation und die Konformation der 7TM Domäne abhängig vom Aktivitätszustand des aGPCR ist, was wiederrum daraufhin deutet, dass der TA über die Interaktion mit der 7TM Domäne eine Konformationsänderung vermittelt, welche letztendlich die Rezeptoraktivität reguliert. Zudem zeigten biochemische Analysen, dass neben der GAIN Domänen-vermittelten Autoproteolyse des humanen aGPCRs CD97 (ADGRE5/E5) weitere proteolytische Spaltungen innerhalb des Rezeptors stattfinden. Dies deutet daraufhin, dass aGPCRs Spaltungskaskaden durchlaufen, welche über die autoproteolytischen Reaktion der GAIN Domäne initialisiert werden. Dadurch kann angenommen werden, dass aGPCRs zusätzlichen proteolytischen Ereignissen unterliegen. Schlussendlich konnte mittels diverser Markierungsverfahren die konstitutive Internalisierung des NTF und des CTF von E5 nachgewiesen werden. Es war möglich beide Fragmente unabhängig voneinander zu markieren und deren subzelluläre Lokalisation in vitro zu verfolgen. Zusammenfassend tragen die gewonnen Ergebnisse zu einem besseren Verständnis der zugrundeliegenden molekularen Mechanismen in Bezug auf Aktivität und Signalübertragung von aGPCRs bei.…