Tina Tylek

• The outcome of the innate immune response to biomaterials mainly determines whether the material will be incorporated in the body to fulfill its desired function or, when it gets encapsulated, will be rejected in the worst case. Macrophages are key players in this process, and their polarization state with either pro- (M1), anti-inflammatory (M2), or intermediate characteristics is crucial for deciding on the biomaterial’s fate. While a transient initial pro-inflammatory state is helpful, a prolonged inflammation deteriorates the proper healingThe outcome of the innate immune response to biomaterials mainly determines whether the material will be incorporated in the body to fulfill its desired function or, when it gets encapsulated, will be rejected in the worst case. Macrophages are key players in this process, and their polarization state with either pro- (M1), anti-inflammatory (M2), or intermediate characteristics is crucial for deciding on the biomaterial’s fate. While a transient initial pro-inflammatory state is helpful, a prolonged inflammation deteriorates the proper healing and subsequent regeneration. Therefore, biomaterial-based polarization may aid in driving macrophages in the desired direction. However, the in vivo process is highly complex, and a mono-culture of macrophages in vitro displays only one part of the cellular system, but, to this date, there is a lack of established co-cultures to assess the immune response to biomaterials. Thus, this thesis aimed to establish a functional co-culture system of human macrophages and human mesenchymal stromal cells (hMSCs) to improve the assessment of the immune response to biomaterials in vitro. Together with macrophages, hMSCs are involved in tissue regeneration and inflammatory reactions and can modulate the immune response. In particular, endogenously derived hMSCs considerably contribute to the successful engrafting of biomaterials. This thesis focused on poly(ε-caprolactone) (PCL) fiber-based scaffolds produced by the technique of melt electrowriting (MEW) as biomaterial constructs. Via this fabrication technique, uniform, precisely ordered scaffolds varying in geometry and pore size have been created in-house. To determine the impact of scaffold geometries and pore sizes on macrophages, mono-cultures incubated on scaffolds were conducted. As a pre-requisite to achieve a functional co-culture system on scaffolds, setups for direct and indirect systems in 2D have initially been established. These setups were analyzed for the capability of cell-cell communication. In parallel, a co-culture medium suitable for both cell types was defined, prior to the establishment of a step-by-step procedure for the co-cultivation of human macrophages and hMSCs on fiber-based scaffolds. Regarding the scaffold morphologies tested within this thesis to improve M2-like polarization, box-shaped scaffolds outperformed triangular-, round- or disordered-shaped ones. Upon further investigation of scaffolds with box-shaped pores and precise inter-fiber spacing from 100 µm down to only 40 µm, decreasing pore sizes facilitated primary human macrophage elongation accompanied by their differentiation towards the M2 type, which was most pronounced for the smallest pore size of 40 µm. To the best of my knowledge, this was the first time that the elongation of human macrophages in a 3D environment has been correlated to their M2-like polarization. Thus, these results may set the stage for the design, the assessment, and the selection of new biomaterials, which can positively affect the tissue regeneration. The cell communication of both cell types, detected via mitochondria exchange in direct and indirect co-cultures systems, took place in both directions, i.e., from hMSCs to macrophages and vice versa. Thereby, in direct co-culture, tunneling nanotubes enabled the transfer from one cell type to the respective other, while in indirect co-culture, a non-directional transfer through extracellular vesicles (EVs) released into the medium seemed likely. Moreover, the phagocytic activity of macrophages after 2D co-cultivation and hence immunomodulation by hMSCs increased with the highest phagocytic rate after 48 h being most pronounced in direct co-cultivation. As the commonly used serum supplements for macrophages and hMSCs, i.e., human serum (hS) and fetal calf serum (FCS), respectively, failed to support the respective other cell type during prolonged cultivation, these sera were replaced by human platelet lysate (hPL), which has been proven to be the optimal supplement for the co-cultivation of human macrophages with hMSCs within this thesis. Thereby, the phenotype of both cell types, the distribution of both cell populations, the phagocytic activity of macrophages, and the gene expression profiles were maintained and comparable to the respective standard mono-culture conditions. This was even true when hPL was applied without the anticoagulant heparin in all cultures with macrophages, and therefore, heparin was omitted for further experiments comprising hPL and macrophages. Accordingly, a step-by-step operating procedure for the co-cultivation on fiber-based scaffolds has been established comprising the setup for 3D cultivation as well as the description of methods for the analysis of phenotypical and molecular changes upon contact with the biomaterial. The evaluation of the macrophage response depending on the cultivation with or without hMSCs and either on scaffolds or on plastic surfaces has been successfully achieved and confirmed the functionality of the suggested procedures. In conclusion, the functional co-culture system of human macrophages and hMSCs established here can now be employed to assess biomaterials in terms of the immune response in a more in vivo-related way. Moreover, specifically designed scaffolds used within the present thesis showed auspicious design criteria positively influencing the macrophage polarization towards the anti-inflammatory, pro-healing type and might be adaptable to other biomaterials in future approaches. Hence, follow-up experiments should focus on the evaluation of the co-culture outcome on promising scaffolds, and the suggested operating procedures should be adjusted to further kinds of biomaterials, such as cements or hydrogels.…
• Der Verlauf der angeborene Immunantwort auf Biomaterialien bestimmt maßgebend, ob das Material vom Körper angenommen wird, um so seine gewünschte Funktion zu erfüllen, oder ob es zur Einkapselung und im schlimmsten Fall zur Abstoßung kommt. Makrophagen spielen in diesem Prozess eine Schlüsselrolle, und ihr Polarisationszustand, entweder pro (M1), antiinflammatorisch (M2) oder ein dazwischenliegender Subtyp, ist dabei von entscheidender Bedeutung. Während ein vorübergehender proinflammatorischer Anfangszustand hilfreich ist, verschlechtert eineDer Verlauf der angeborene Immunantwort auf Biomaterialien bestimmt maßgebend, ob das Material vom Körper angenommen wird, um so seine gewünschte Funktion zu erfüllen, oder ob es zur Einkapselung und im schlimmsten Fall zur Abstoßung kommt. Makrophagen spielen in diesem Prozess eine Schlüsselrolle, und ihr Polarisationszustand, entweder pro (M1), antiinflammatorisch (M2) oder ein dazwischenliegender Subtyp, ist dabei von entscheidender Bedeutung. Während ein vorübergehender proinflammatorischer Anfangszustand hilfreich ist, verschlechtert eine anhaltende Entzündung eine zeitnahe Heilung und die anschließende Regeneration. Daher könnte eine durch Biomaterialien beeinflusste Polarisation hilfreich sein, um die Makrophagen in die gewünschte Richtung zu lenken. Die in vivo Reaktion ist jedoch äußerst komplex und die Kultivierung von Makrophagen in vitro stellt nur einen Teil des Prozesses dar. An etablierten Co-Kultursystem zur Untersuchung der immunmodulierenden Eigenschaften von Biomaterialien mangelt es jedoch. Daher war es Ziel dieser Arbeit ein funktionelles Co-Kultursystem von humanen Makrophagen und humanen mesenchymalen Stromazellen (hMSCs) zu etablieren um die in vitro Bewertung der Immunantwort nach Kontakt mit Biomaterialien zu verbessern. Von Interesse sind hMSCs hierbei, da sie zusammen mit Makrophagen an der Geweberegeneration und an Entzündungsreaktionen beteiligt sind. Zudem weisen MSCs immunmodulierende Eigenschaften in Hinblick auf Makrophagen auf und sind aktiv am Verlauf der Fremdkörperreaktion nach der Transplantation von Biomaterial beteiligt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Poly(ε-caprolactone) (PCL)-Scaffolds auf Faserbasis als Biomaterialkonstrukte verwendet, welche mit der Technik des Melt Electrowriting (MEW) hergestellt wurden. Mit dieser Technik kann sowohl die Form der Scaffolds als auch die Porengröße variiert werden. Um Unterschiede der Scaffoldgeometrien und Porengrößen in Hinblick auf die Makrophagenreaktion zu untersuchen, wurden zunächst Versuche mit Makrophagen-Monokulturen durchgeführt. Zur Etablierung eines funktionellen Co-Kultursystem, wurde zu Beginn ein Aufbau für ein direktes und indirektes System in 2D erstellt. Dieser Aufbau wurde anschließend auf die Möglichkeit der Zell-Zell-Kommunikation darin analysiert. Weiterhin wurde ein, für beide Zelltypen, geeignetes Kulturmedium definiert, gefolgt von der Etablierung eines Protokoll für die Co-Kultivierung beider Zelltypen auf faserbasierten Scaffolds. Im Bezug zu dieser Arbeit wurden Scaffolds mit unterschiedlicher Geometrie mittels der Technik des Melt Electrowriting hergestellt um die Veränderung der Makrophagenpolarisation zu untersuchen. Dabei zeigte sich eine verstärkte M2-Polarisation auf Scaffolds mit einer kastenförmigen Morphologie, verglichen mit dreieckigen, runden oder ungeordnet-strukturierten Scaffolds. Die weitere Untersuchung von Scaffolds mit kastenförmigen Poren und präzisen Faserabständen von 100 µm bis zu 40 µm zeigte das kleinere Porengrößen die Elongation primärer menschlicher Makrophagen förderten. Begleitet wurde die verstärkte Elongation mit einer gesteigerten Polarisation in Richtung des M2 Typs. Dieser Effekt war nach Kultivierung von Makrophagen auf Scaffolds mit 40 µm Poren am stärksten ausgeprägt. Im Rahmen dieser Arbeit konnte damit erstmals eine länglichen Morphologie humaner Makrophagen mit einer Polarisierung in den M2 Typ korreliert werden. Diese Ergebnisse könnten daher für das Design neuer Biomaterialien, welche sich positiv auf die Geweberegeneration auswirken sollen, von Bedeutung sein. Die Zellkommunikation beider Zelltypen, welche über Mitochondrienaustausch im direkten und indirekten Co-Kultur-System nachgewiesen wurde, fand sowohl ausgehend von Makrophagen als auch von hMSCs statt. Dabei ermöglichten „Tunneling Nanotubes“ in der direkten Co-Kultur den Transfer von Mitochondrien von einem Zelltyp zum jeweils anderen, während in der indirekter Co-Kultur ein ungerichteter Transfer durch in das Medium freigesetzte extrazelluläre Vesikel (EVs) stattfand. Darüber hinaus wurde die phagozytotische Aktivität von Makrophagen nach Co-Kultivierung untersucht, um die immunmodulatorischen Eigenschaften von hMSCs nachzuweisen, wobei die höchste phagozytotische Aktivität nach 48 stündiger Co-Kultivierung festgestellt wurde. Da die üblicherweise verwendeten Serumzusätze für Makrophagen (humanes Serum (hS)) und hMSCs (fötales Kälberserum (FCS)) bei längerer Kultivierung den jeweils anderen Zelltyp nicht unterstützen konnten, wurden diese Seren durch humanes Thrombozytenlysat (hPL) ersetzt. Dieses erwies sich im Rahmen dieser Arbeit als optimale Ergänzung für die gemeinsame Kultivierung beider Zelltypen in der Co-Kultur. Dabei wurden der Phänotyp und die Populationsverteilung beider Zelltypen, sowie die phagozytotische Aktivität und die Veränderung des Genexpressionsprofils von Makrophagen untersucht und mit den jeweiligen Standard-Monokulturbedingungen verglichen. Des Weiteren konnte gezeigt werde, dass eine Zugabe von Heparin in Zellkulturen mit Makrophagen und hPL nicht nötig ist. Daher wurde auf den Zusatz von Heparin für alle weitere Experimente, die hPL und Makrophagen umfassten, verzichtet. Im letzten Teil der Arbeit wurde ein Protokoll für die Co-Kultivierung auf MEW Scaffolds erstellt. Neben der Etablierung eines Setups für die 3D-Kultivierung wurden sowohl Protokolle zur Bewertung phänotypischer als auch molekularer Veränderungen entwickelt. Durch Feststellung von Unterschieden in der Makrophagenreaktion in Abhängigkeit zu der Kultivierung mit / ohne hMSCs und entweder auf Scaffolds oder Plastik-Kulturschalen konnte die Funktionalität der Protokolle nachgewiesen werden. Mit dem in dieser Arbeit etabliertem funktionellen Co-Kultursystem von humanen Makrophagen und hMSCs können zukünftig Biomaterialien mit einem stärkeren in vivo -Bezug in Hinblick auf die Immunantwort bewertet werden. Darüber hinaus deuten Ergebnisse auf speziell konstruierte MEW-Scaffolds ein vielversprechendes Designkriterium für neu entwickelte Biomaterialien an, wobei die Polarisation der Makrophagen in Richtung des entzündungshemmenden, heilungsfördernden Typens durch eine gesteuerte Morphologieänderung beeinflusst werden kann. An diese Arbeit anschließende Experimente sollten sich auf die Untersuchung vielversprechender Scaffolds mittels Co-Kultivierung sowie auf die Anpassung der etablierten Protokolle an andere Biomaterialgruppen, wie beispielsweiße für Zemente oder Hydrogele, konzentrieren.…