Eva-Katharina Glückert

• Der neurotrophe Wachstumsfaktor BDNF gehört neben NGF, NT-3 und NT-4/5 zur Familie der Neurotrophine. Er spielt eine wichtige Rolle für Überleben und Differenzierung von Nervenzellen und ist insbesondere auch verantwortlich für die Regulation synaptischer Plastizität. Besonders im Hippocampus, dem Ort der höchsten Expression von BDNF im adulten Gehirn, wirkt BDNF bei den Vorgängen von Lernen und Gedächtnis mit, welches als Phänomen der LTP untersucht werden kann. Bisher ist eine Lokalisation von BDNF-Protein mittels Immunfluoreszenz-TechnikenDer neurotrophe Wachstumsfaktor BDNF gehört neben NGF, NT-3 und NT-4/5 zur Familie der Neurotrophine. Er spielt eine wichtige Rolle für Überleben und Differenzierung von Nervenzellen und ist insbesondere auch verantwortlich für die Regulation synaptischer Plastizität. Besonders im Hippocampus, dem Ort der höchsten Expression von BDNF im adulten Gehirn, wirkt BDNF bei den Vorgängen von Lernen und Gedächtnis mit, welches als Phänomen der LTP untersucht werden kann. Bisher ist eine Lokalisation von BDNF-Protein mittels Immunfluoreszenz-Techniken im Gehirn der Maus oder Ratte nur sehr schwer gelungen. In den meisten Arbeiten gelang die Lokalisation von BDNF über den Nachweis von mRNA oder im Western Blot, die Gruppe von Conner et al. konnte einen qualitativen Nachweis von BDNF-Protein mittels eines eigens hergestellten Antiserums erbringen (Conner et al. 1997). Das Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung eines Antiserums gegen BDNF zur subzellulären Lokalisation mittels Immunhistochemie. Durch die Verwendung von Immunfluoreszenz-gekoppelten Sekundärantikörpern sollte zum einen eine quantitative Bestimmung von BDNF möglich sein, zum anderen sollte durch die Möglichkeit einer nahezu dreidimensionalen Darstellung des Gewebes mittels Vibratomschnitten auch eine Aussage über eine genauere Lokalisation von BDNF gemacht werden können. Um den immunhistochemischen Nachweis von BDNF-Protein im Hippocampus der Maus mittels Immunfluoreszenz führen zu können, wurde zunächst ein geeignetes Anti-serum benötigt. Zwei zu Vergleichszwecken ausgetestete kommerzielle Antikörper zeigten keine Färbung. Nach dem Vorbild zweier Arbeitsgruppen (Yan et al. 1997b und Conner et al. 1996, 1997) wurde ein Antiserum gegen humanes rekombinantes BDNF in Kaninchen hergestellt. Das Antiserum erhielt den Namen „BDNF RabbitB“. Die Spezifität des Antiserums wurde mittels Western Blot und in der Zellkultur anhand von Hühnchen-DRGs überprüft. Im Western Blot zeigte das Antiserum eine spezifische Anfärbung von rekombinantem BDNF sowie im Hippocampus-Proteinextrakt. In der Kontrolle mit Präimmunserum zeigte sich keine Anfärbung. In der Zellkultur mit Hühnchen-DRGs konnte eine blockierende Wirkung des Antiserums in Gegenwart von BDNF als neurotrophem Wachstumsfaktor im Zellkulturmedium nachgewiesen werden, es zeigte sich eine signifikante Reduktion des Überlebens von Zellen bei einer Verdünnung des Antiserums von 1:1.000. Das Präimmunserum zeigte keine Wirkung. Eine Kreuzreaktivität mit NGF als strukturähnlichem Protein konnte ausgeschlossen werden, da das Antiserum in Gegenwart von NGF im Kulturmedium keine Wirkung zeigte. Anschließend galt es, die Methoden für die Immunhistochemie mit diesem Antiserum zu optimieren, da es Hinweise gab, daß gerade die Immunhistochemie neurotropher Faktoren sehr sensibel auf verschiedene Methoden reagiert. Daher wurden sowohl die Fixierungsmethode, unterschiedliche Gewebeschnitte, verschiedene Puffersysteme und immunhistochemische Färbemethoden untersucht und verglichen. Die Standard-Fixierungsmethode mit Phosphat-Puffer, modifiziert nach der Methode nach Yan et al. 1997b mit maximal 2 h Nachfixierung stellte sich als beste Methode heraus. Eine Kombination zweier verschiedener Puffer (TBS und PB) innerhalb der Fixierung ist ungünstig. Daher sollte innerhalb einer Methode immer bei einem Puffersystem geblieben werden, wobei hier insgesamt bei dem Vergleich von PBS, TBS und TRIS-Puffer sowohl in der Fixierung als auch in der Färbemethode dem Phosphat-Puffer der Vorzug gegeben wird, welches auch das Standard-System darstellt. Bei den Gewebeschnitten sind, wie ursprünglich geplant Vibratomschnitte zu bevorzugen. Insgesamt konnten jedoch mögliche Ursachen für die Anfälligkeit der BDNF-Immunreaktivität bei Fixierungs- und Färbemethoden hier nicht abschließend erklärt werden. Problematisch war die ausgeprägte Hintergrundfärbung des Antiserums v.a. in der Immunhistochemie, die nicht ausreichend behoben werden konnte. Insofern sollte das Antiserum für die Verwendung bei immunhistochemischen Färbungen noch weiter optimiert werden. Für die Verwendung in der Zellkultur ist das Antiserum auf Grund seiner BDNF-blockierenden Eigenschaften gut einsetzbar. Im Western Blot sollte „BDNF RabbitB“ in einer Verdünnung von 1:5.000, in Zellkultur mit 1:1.000 und in der Immunhistochemie mit Vibratomschnitten mit 1:2.000 eingesetzt werden.…