Verena Surrey

• Spinal muscular atrophy with respiratory distress type 1 (SMARD1) is a fatal monogenic motoneuron disease in children with unknown etiology caused by mutations in the immunoglobulin μ-binding protein 2 (IGHMBP2) gene coding for DNA/RNA ATPase/helicase. Despite detailed knowledge of the underlying genetic changes, the cellular mechanisms leading to this disease are not well understood. In the Nmd2J ("neuromuscular disorder") mouse, the mouse model for the juvenile form of SMARD1 patients, in which similar pathological features as diaphragmaticSpinal muscular atrophy with respiratory distress type 1 (SMARD1) is a fatal monogenic motoneuron disease in children with unknown etiology caused by mutations in the immunoglobulin μ-binding protein 2 (IGHMBP2) gene coding for DNA/RNA ATPase/helicase. Despite detailed knowledge of the underlying genetic changes, the cellular mechanisms leading to this disease are not well understood. In the Nmd2J ("neuromuscular disorder") mouse, the mouse model for the juvenile form of SMARD1 patients, in which similar pathological features as diaphragmatic paralysis and skeletal muscle atrophy are observed. Ex vivo studies in Nmd2J mice showed that loss of the motor axon precedes atrophy of the gastrocnemius muscle and does not correlate with neurotransmission defects in the motor endplate. The already described independent myogenic anomalies in the diaphragm and heart of the Nmd2J mouse raised the question whether spinal motoneuron degeneration develops cell autonomously. Ighmbp2 is predominantly localized in the cytoplasm and seems to bind to ribosomes and polysomes, suggesting a role in mRNA metabolism. In this Ph.D. thesis, morphological and functional analyses of isolated Ighmbp2-deficient (Ighmbp2-def.) motoneurons were performed to answer the question whether the SMARD1 phenotype results from dysregulation of protein biosynthesis. Ighmbp2-deficient motoneurons show only negligible morphological alterations with respect to a slight increase in axonal branches. This observation is consistent with only minor changes of transcriptome based on RNA sequencing data from Ighmbp2-deficient motoneurons. Only the mRNA of fibroblast growth factor receptor 1 (Fgfr1) showed significant up-regulation in Ighmbp2-deficient motoneurons. Furthermore, no global aberrations at the translational level could be detected using pulsed SILAC (Stable Isotope Labeling by Amino acids in cell culture), AHA (L-azidohomoalanine) labeling and SUnSET (SUrface SEnsing of Translation) methods. However, a reduced β-actin protein level was observed at the growth cones of Ighmbp2-deficient motoneurons, which was accompanied with a reduced level of Imp1 protein, a known β-actin mRNA interactor. Live-cell imaging studies using fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) showed translational down-regulation of eGFPmyr-β-actin 3'UTR mRNA in the growth cones and the cell bodies, although the amount of β-actin mRNA and the total protein amount in Ighmbp2-deficient motoneurons showed no aberrations. This compartment-specific reduction of β-actin protein occurred independently of a non-existent direct IGHMBPF2 binding to β-actin mRNA. Fgfr1, which was upregulated on the RNA level, did not show an increased protein amount in Ighmbp2-deficient motoneurons, whereas a reduced amount could be detected. Interestingly, a correlation could be found between the reduced amount of the Imp1 protein and the increased Fgfr1 mRNA, since the IMP1 protein binds the FGFR1 mRNA and thus could influence the transport and translation of FGFR1 mRNA. In summary, all data suggest that Ighmbp2 deficiency leads to a local but modest disturbance of protein biosynthesis, which might contribute to the motoneuron defects of SMARD1.…
• Die spinale Muskelatrophie mit Atemnot Typ 1 (SMARD1) ist eine tödliche, monogene Motoneuron-Erkrankung bei Kindern mit unbekannter Ätiologie. SMARD1 wird durch Mutationen im Immunoglobulin µ-bindenden Protein 2 (IGHMBP2)-Gen verursacht, welches für eine DNA/RNA ATPase/Helikase kodiert. Trotz detaillierter Kenntnisse über die zugrunde liegenden genetischen Veränderungen sind die zellulären Mechanismen, die zu dieser Krankheit führen, nicht gut verstanden. In der Nmd2J („neuromuscular disorder“) Maus, dem Mausmodell für die juvenile Form vonDie spinale Muskelatrophie mit Atemnot Typ 1 (SMARD1) ist eine tödliche, monogene Motoneuron-Erkrankung bei Kindern mit unbekannter Ätiologie. SMARD1 wird durch Mutationen im Immunoglobulin µ-bindenden Protein 2 (IGHMBP2)-Gen verursacht, welches für eine DNA/RNA ATPase/Helikase kodiert. Trotz detaillierter Kenntnisse über die zugrunde liegenden genetischen Veränderungen sind die zellulären Mechanismen, die zu dieser Krankheit führen, nicht gut verstanden. In der Nmd2J („neuromuscular disorder“) Maus, dem Mausmodell für die juvenile Form von SMARD1-Patienten, werden ähnliche pathologische Merkmale wie Diaphragma-Lähmung und Skelettmuskelatrophie beobachtet. Ex vivo-Studien an Nmd2J-Mäusen zeigten, dass der Verlust des motorischen Axons einer Atrophie des Gastrocnemius-Muskels vorausgeht und nicht mit Neurotransmissionsfehlern an der motorischen Endplatte korreliert. Die bereits beschriebenen, unabhängig auftretenden myogenen Anomalien in Zwerchfell und Herz der Nmd2J-Maus führten zu der Frage, ob sich die spinale Motoneuron-Degeneration zellautonom entwickelt. Ighmbp2 ist prädominant im Zytoplasma lokalisiert und scheint an Ribosomen und Polysomen zu binden, was auf eine Rolle im mRNA-Stoffwechsel hindeutet. In dieser Doktorarbeit wurden morphologische und funktionelle Analysen von isolierten Ighmbp2-defizienten (Ighmbp2-def.) Motoneuronen durchgeführt, um die Frage zu beantworten, ob der SMARD1-Phänotyp aus der Deregulierung der Proteinbiosynthese resultiert. Ighmbp2-defiziente Motoneuronen weisen nur geringfügige morphologische Unterschiede hinsichtlich einer leichten Zunahme der axonalen Verzweigungen auf. Diese Beobachtung steht im Einklang mit nur geringen Veränderungen im Transkriptom basierend auf den RNA-Sequenzierungs-Daten in Ighmbp2-defizienten Motoneuronen. Ausschließlich die mRNA des Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptor 1 (Fgfr1) zeigte eine signifikante Hoch-Regulation in Ighmbp2-defizienten Motoneuronen. Des Weiteren konnten keine globalen Aberrationen auf der translationalen Ebene mit Hilfe der gepulsten SILAC (Stable Isotope Labeling by Amino acids in der Zellkultur), AHA (L-Azidohomoalanin)-Markierung und der SUnSET (SUrface SEnsing of Translation) Methoden ermittelt werden. Jedoch konnte eine verringerte β-actin Proteinmenge an den Wachstumskegeln von Ighmbp2-defizienten Motoneuronen beobachtet werden, die von einer Reduktion an Imp1 Protein, einem bekannten β-actin mRNA Interaktor, begleitet wurde. Lebendzell-Bildgebungsstudien mittels Fluoreszenz-Recovery after Photobleaching (FRAP) Untersuchung zeigten eine translatorische Herunter-Regulation der eGFPmyr-β-actin 3‘UTR mRNA in Wachstumskegeln und Zellkörpern, obwohl die Menge an β-actin mRNA und die Gesamt-Proteinmenge in Ighmbp2-defizienten Motoneuronen im Vergleich zu wildtypischen Motoneuronen unverändert war. Diese Kompartiment-spezifische Reduktion von β-actin Protein trat unabhängig von einer nicht vorhandenen direkten IGHMBP2-Bindung an die β-actin mRNA auf. Der auf RNA Ebene hochregulierte Fgfr1 zeigte hingegen keine erhöhte, aber eine verringerte Proteinmenge in Ighmbp2-defizienten Motoneuronen. Interessanterweise konnte ein Zusammenhang zwischen der reduzierten Menge des Imp1 Proteins und der erhöhten FGFR1 mRNA gezogen werden. Da das IMP1 Protein neben der β-actin mRNA ebenfalls die FGFR1 mRNA bindet, könnte es so den Transport und die Translation beeinflussen. Alle Daten deuten zusammenfassend daraufhin, dass Ighmbp2-Mangel zu einer lokalen und geringen Störung der Proteinbiosynthese führt, die aber durchaus zu den beobachteten Motoneuron-Defekten in SMARD1 beitragen könnte.…