Isabell Motsch

• Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD) is a rare genetic disorder characterised by early contractures of the elbows, Achilles tendons and spine, slowly progressive muscle wasting and cardiomyopathy associated with cardiac conduction defect. The autosomal dominant form is caused by mutations in the LMNA gene which gives rise to lamin A and lamin C proteins by alternative splicing. These A-type lamins, together with B-type lamins, form the nuclear lamina, a network of intermediate filament proteins underlining the nuclear envelope. In order toEmery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD) is a rare genetic disorder characterised by early contractures of the elbows, Achilles tendons and spine, slowly progressive muscle wasting and cardiomyopathy associated with cardiac conduction defect. The autosomal dominant form is caused by mutations in the LMNA gene which gives rise to lamin A and lamin C proteins by alternative splicing. These A-type lamins, together with B-type lamins, form the nuclear lamina, a network of intermediate filament proteins underlining the nuclear envelope. In order to ascertain the role lamin A and C separately contribute to the molecular phenotype, we analysed ten LMNA mutations and one single nucleotide polymorphism (SNP) in transfection studies in COS7 fibroblasts and, partially, in C2C12 myoblasts. The EGFP or DsRed2 tagged lamins were exogenously expressed either individually or both A-types together and examined by light and electron microscopy. The protein mobility of lamin A mutants was determined by FRAP analysis. Additionally, a co-immunoprecipitation binding assay of in vitro synthesised A-type lamins and emerin was performed.Eight of the LMNA mutations (R50S, R133P, E358K, E358K+C<T1698, E361K, R527P, L530P, R541S and G602S) and the SNP C<T1698, when expressed in lamin A, exhibited a range of nuclear mis-localisation patterns from a wild type phenotype to the formation of nuclear aggregates. Two mutations (T150P and delQ355) led to the severe mis-localisation of the exogenous protein and additionally affected nuclear envelope reassembly and mid-body protein composition after mitosis. Exogenously expressed DsRed2 tagged wild type and mutant lamin C was only inserted into the nuclear lamina if co-expressed with the equivalent EGFP tagged lamin A construct, except for the T150P mutation which prevented either lamin from reaching the nuclear lamina. The T150P, R527P and L530P mutations reduced the ability of lamin A, but not lamin C from binding to emerin. These data indicate that mutations in the rod domain of lamin A mainly impair its function as a structural protein, whereas mutations of the globular tail domain appear to disrupt protein-protein interactions important for gene regulation and signal transduction processes. In addition, our results suggest specific functional roles for the emerin-lamin A and emerin-lamin C containing protein complexes; this is the first report to propose that the A-type lamin mutations may be differentially dysfunctional for the same LMNA mutation.…
• Die Emery-Dreifuss Muskeldystrophie, ein seltene genetische Erkrankung, ist gekennzeichnet durch frühzeitige Sehnenverkürzung im Ellenbogen, an der Achillessehne und am Rückgrat, einen langsam fortschreitenden Muskelschwund sowie einer Kardiomyopathie mit Herzreizleitungsstörungen. Die autosomal-dominante Form wird von Mutationen im LMNA-Gen verursacht, welches durch alternatives Spleißen die Laminproteine A und C hervorbringt. Diese sogenannten A-Typ Lamine bilden zusammen mit den B-Typ Laminen die Kernlamina, ein Netzwerk ausDie Emery-Dreifuss Muskeldystrophie, ein seltene genetische Erkrankung, ist gekennzeichnet durch frühzeitige Sehnenverkürzung im Ellenbogen, an der Achillessehne und am Rückgrat, einen langsam fortschreitenden Muskelschwund sowie einer Kardiomyopathie mit Herzreizleitungsstörungen. Die autosomal-dominante Form wird von Mutationen im LMNA-Gen verursacht, welches durch alternatives Spleißen die Laminproteine A und C hervorbringt. Diese sogenannten A-Typ Lamine bilden zusammen mit den B-Typ Laminen die Kernlamina, ein Netzwerk aus Intermediär-filamentproteinen, welches innen an der Kernhülle anliegt. Um festzustellen, inwiefern Lamin A und Lamin C jeweils einzeln zum molekularen Phänotyp beitragen, wurden zehn LMNA-Mutationen und ein Einzelnukleotid-Polymorphismus (SNP) in Transfektionsstudien mit COS7-Fibroblasten, und teilweise auch C2C12-Myoblasten, analysiert. Die EGFP- oder DsRed2-markierten Lamine wurden entweder einzeln oder beide A-Typ Lamine zusammen exogen exprimiert und sowohl licht- als auch elektronenmikroskopisch untersucht. Die Beweglichkeit von Lamin A-Mutanten in der Kernlamina wurde durch FRAP-Analyse ermittelt und zusätzlich Ko-Immunpräzipitationsbindungsstudien mit in vitro hergestellten A-Typ Laminproteinen und Emerin durchgeführt. Exprimiert in Lamin A wiesen acht Mutationen (R50S, R133P, E358K, E358K+ C<T1698, E361K, R527P, L530P, R541S und G602S) sowie der SNP C<T1698 eine große Bandbreite an Fehl-verteilungsmustern im Kern auf, welche von der wildtypischen Verteilung bis zur Bildung von Proteinaggregaten im Kern reichte. Zwei Mutationen (T150P und delQ355) führten zu extremer Mislokalisation des exogenen Proteins und beeinflussten außerdem den Wiederaufbau der Kernhülle nach der Mitose sowie die Proteinzusammensetzung des Mid-bodies. Sowohl der Wildtyp als auch alle Mutanten von DsRed2-markiertem Lamin C wurde nur in die Kernlamina eingebaut, wenn gleichzeitig auch dessen Lamin A-Gegenstück (EGFP-markiert) exogen exprimiert wurde. Als Ausnahme verhinderte die Mutation T150P den Einbau beider A-Typ Lamine in die Lamina. Die LMNA-Mutationen T150P, R527P und L530P verringerten die Bindung von Emerin an Lamin A, aber nicht die an Lamin C. Diese Daten deuten darauf hin, dass Mutationen in der stäbchenförmigen Domäne von Lamin A hauptsächlich dessen Funktion als Strukturprotein beeinträchtigen, wohingegen Mutationen in der globulären Schwanzdomäne Protein-Protein-Interaktionen zu behindern scheinen, die bei der Genregulation und Signaltransduktion von Bedeutung sind. Zusätzlich schlagen diese Ergebnisse spezifische funktionelle Rollen für die Emerin-Lamin A und Emerin-Lamin C-Proteinkomplexe vor, was darauf schließen lässt, dass die beiden A-Typ Lamine durch dieselbe LMNA-Mutation unterschiedlich in ihrer Funktion gestört werden.…