Markus Hildenbrand

• Die Basis der vorliegenden Arbeit bildet die Eigenentwicklung eines neuen massiv verbesserten Experimentalaufbaus einer dynamischen Lichtstreuapparatur zur Untersuchung von kollektiven Membranbewegungen. Die technischen Verbesserungen ermöglichten Messungen in einem bisher nicht zugänglichen Wellenzahlbereich der Membranundulationen. Dadurch konnte eine präzise Untersuchung der Abhängigkeiten der ihnen zugrunde liegenden mikromechanischen Größen Membranspannung und Membranviskosität von verschiedenen intrinsischen und extrinsischen ParameternDie Basis der vorliegenden Arbeit bildet die Eigenentwicklung eines neuen massiv verbesserten Experimentalaufbaus einer dynamischen Lichtstreuapparatur zur Untersuchung von kollektiven Membranbewegungen. Die technischen Verbesserungen ermöglichten Messungen in einem bisher nicht zugänglichen Wellenzahlbereich der Membranundulationen. Dadurch konnte eine präzise Untersuchung der Abhängigkeiten der ihnen zugrunde liegenden mikromechanischen Größen Membranspannung und Membranviskosität von verschiedenen intrinsischen und extrinsischen Parametern durchgeführt werden. Im ersten Teil der Arbeit werden fundamentale Untersuchungen zur Charakterisierung der Membranspannung beschrieben. Eine Vergrößerung der Temperatur oder des Anteils an geladenem Lipid bei Lipidmischungen führte zu einer Erhöhung der Membranspannung. Diese Parameter besitzen aber keinen messbaren Einfluss auf die Membranviskosität. Im zweiten Teil der Arbeit wurde der Ankopplungsmechanismus von kurzen DNA-Stücken an kationische Membranen und deren Einfluss auf die Membranparameter untersucht. Die Experimente konzentrierten sich auf den Vergleich kurzer DNA Doppelstränge (ds-DNA) und Einzelstränge (ss-DNA). Die Adsorption der beiden DNA-Typen zeigte für die in der Dynamischen Lichtstreuung (DLS) messbaren charakteristischen Membrangrößen signifikante Unterschiede. Während die ds-DNA die Membranspannung und die Membranviskosität im Vergleich zu einer Membran ohne DNA Adsorption erhöhte, wurde durch die ss-DNA die Membranviskosität nicht verändert und die Membranspannung sogar erniedrigt. Die kurze ds-DNA (≤ 50 Basenpaare) beeinflusste die Undulationen durch eine rein elektrostatische Kopplung an die entgegengesetzt geladene Membranoberfläche, ohne in diese einzudringen. Die kurzen ss-DNA-Stränge zeigten neben der elektrostatischen Kopplung ein zumindest partielles Eintauchen in die Membran mit drastischen Auswirkungen auf deren mikromechanische Eigenschaften, die im völligen Gegensatz zur doppelsträngigen DNA standen. Die DLS erwies sich in diesen Experimenten als extrem empfindliche Methode, die sogar die Längenunterschiede der kurzen DNA-Stränge detektieren konnte. Im dritten Teil der Arbeit wurde der Einfluss der drei evolutionsbiologisch bedeutsamsten Steroide Lanosterol, Ergosterol und Cholesterol auf die kollektive Membrandynamik studiert. Ziel war es, die möglichen Korrelationen zwischen der molekularen Struktur der Steroide und den makroskopischen Funktionen der Komposit-Membranen zu identifizieren. Die drei untersuchten Steroide besitzen eine sehr ähnliche Struktur, unterscheiden sich jedoch sehr in ihrer molekularen Dynamik. Die Messung der kollektiven Dynamik der Undulationen konnte teils erstaunliche Auswirkungen aufdecken. Ergosterol versteift durch seine Anwesenheit die Membran und erhöht die Membranspannung, verkürzt allerdings die Haltbarkeit der Membranen. Lanosterol erhöht die Membranspannung wesentlich stärker, macht aber die Membranen etwas flexibler als Ergosterol, was sich auch positiv auf die Haltbarkeit auswirkt. Das Cholesterol ist aber das Einzige, das aufgrund seiner molekularen Dynamik bis in die andere Hälfte der zweischichtigen Membran vordringen kann. Damit koppelt es beide Schichten dynamisch miteinander, wodurch die Membran extrem flexibel und dadurch widerstandsfähiger wird. Künstliche Cholesterolmembranen (Durchmesser 3,5 mm) weisen daher eine äußerst erstaunliche Haltbarkeit von bis zu 9 Tagen auf. Unterschiede in der Membranspannung bedingen zum Teil extreme Änderungen der kollektiven Undulationsfrequenzen. Erst das Cholesterol scheint durch ein Zusammenspiel der Membranspannung mit der Membranviskosität, die im Gegensatz zu den anderen Steroiden beide extrem erhöht werden, eine für Eukaryonten biologisch sinnvolle Abstimmung zu bieten. Die sehr hohe Membranviskosität wirkt der Frequenzerhöhung durch die Membranspannung entscheidend entgegen. Dieser Umstand ermöglicht es Zellen, dass sie die Vorteile des Cholesterols nutzen können und dennoch moderate kollektive Bewegungen stattfinden, die nicht durch sehr hohe Frequenzen Zell-Zell- oder Molekül-Zell-Interaktionen außerordentlich erschweren.…
• The basis of this thesis is a proprietary development of a new experimental setup of a dynamic light scattering device for the investigation of collective membrane motions. The huge technical improvements allowed measurements in range of wave numbers of membrane undulations not accessible before and the accurate analysis of the dependency of underlying micromechanic quantities like membrane tension and membrane viscosity from different intrinsic and extrinsic parameters. In the first part of the thesis some fundamental measurements for theThe basis of this thesis is a proprietary development of a new experimental setup of a dynamic light scattering device for the investigation of collective membrane motions. The huge technical improvements allowed measurements in range of wave numbers of membrane undulations not accessible before and the accurate analysis of the dependency of underlying micromechanic quantities like membrane tension and membrane viscosity from different intrinsic and extrinsic parameters. In the first part of the thesis some fundamental measurements for the characterization of the membrane tension are described. Increasing the temperature or the share of charged lipids in lipid mixtures led to an increase of the membrane tension. But these variables didn’t show a measurable influence on the membrane viscosity. The second part of the thesis focused on the coupling mechanism of short DNA-strands with a cationic membrane and their influence on the membrane parameters. In the experiments short double stranded DNA (ds-DNA) and short single stranded DNA (ss-DNA) were compared. The adsorption of both types of DNA has shown significant differences on the characteristic membrane parameters, which are accessible for the Dynamic Light Scattering (DLS). Whereas the ds-DNA increased the membrane tension and the membrane viscosity in comparison to a membrane without DNA adsorption, the ss-DNA left the membrane viscosity unchanged and even decreased the membrane tension. The short ds-DNA (≤ 50 base pairs) affects the undulations only by an electrostatic coupling to the oppositely charged membrane surface, but without intrusion. The short ss-DNA was showing at least a partial intrusion into the membrane besides the electrostatic coupling, which had dramatic consequences for the micromechanic properties contrary to the ds-DNA. DLS proved to be an extremely sensitive method, which was even able to discriminate the effects caused by different chain length of the short DNA strands. In the third part of the thesis the influence of three steroids, namely lanosterol, ergosterol, and cholesterol on the collective membrane dynamics was studied, which played a significant role during the evolution. The intention was to identify the possible correlation between the molecular steroid structure and the macroscopic function of the composite membrane. The three examined steroids have a similar structure but differ highly in their molecular dynamics. The collective dynamics of the undulations revealed partly astonishing results. Ergosterol stiffens the membrane by its presence and increases the membrane tension, but shortens the lifetime of the artificial membranes. Lanosterol increases the membrane tension significantly more, but provides a better membrane flexibility than ergosterol, which causes a higher durability of the membranes. Cholesterol is the only steroid that can penetrate into the opposite layer of the membrane bilayer due to its unique molecular dynamics. It dynamically couples both layers, which leads to highly flexible and therefore more durable membranes. Hence, artificial cholesterol membranes (diameter 3.5 mm) feature an amazing lifetime of up to 9 days. Differences in the membrane tension could affect extreme changes of the collective undulation eigenfrequencies. Only cholesterol is able to provide a biological reasonable conformance for the eukaryotes by the cooperation of membrane tension and membrane viscosity, which are in contrast to the other steroids both extremely increased. The very high membrane viscosity counteracts the increase of the eigenfrequencies caused by the membrane tension. This enables cells to benefit of the advantages of cholesterol by simultaneously having moderate collective motions, which doesn’t make cell-cell or molecule-cell interactions exceedingly difficult by to high frequencies.…