Frank Heckel

• Das Ziel dieser Arbeit war die Anwendung intakter Mikroorganismen auf organische Sulfide zur asymmetrischen Synthese von optisch aktiven Sulfoxiden. Die im Vergleich zu den aufwendigen und teueren Reaktionen mit isolierten Enzymen besonders effizienten Rahmenbedingungen bei sogenannten `whole-cell´-Umsetzungen stellten den Grund für die Bemühungen in dem stetig an Bedeutung gewinnenden Arbeitsfeld der Bioorganischen Chemie dar. Die wesentlichen Ergebnisse dieser Studien sind im Folgenden zusammengefasst: 1. Die Mikroorganismen wurden isoliert,Das Ziel dieser Arbeit war die Anwendung intakter Mikroorganismen auf organische Sulfide zur asymmetrischen Synthese von optisch aktiven Sulfoxiden. Die im Vergleich zu den aufwendigen und teueren Reaktionen mit isolierten Enzymen besonders effizienten Rahmenbedingungen bei sogenannten `whole-cell´-Umsetzungen stellten den Grund für die Bemühungen in dem stetig an Bedeutung gewinnenden Arbeitsfeld der Bioorganischen Chemie dar. Die wesentlichen Ergebnisse dieser Studien sind im Folgenden zusammengefasst: 1. Die Mikroorganismen wurden isoliert, singularisiert und kultiviert. Eine Bodenprobe diente als Quelle für eine Vielzahl an Bakterien, Hefen und Pilzen, die mit dem Standardsubstrat Thioanisol auf ihre Fähigkeit zur enantioselektiven Sulfoxidation überprüft wurden. 2. Insgesamt sind sechs Keime nach standardisierten Methoden genotypisch charakterisiert und den entsprechenden Spezies zugeordnet worden. Die beiden Bakterienstämme mit den bei der Sulfoxidation höchsten Enantiomeren-überschüssen (ee-Werten), nämlich Arthrobacter aurescens (bildete das S-Enantiomer) und Pseudomonas frederiksbergensis (lieferte das R-Enantiomer), wurden für nachfolgende Biosynthesen verwendet. Pseudomonas frederiksbergensis war der einzige Stamm, der das R-Enantiomer im Überschuss produzierte. 3. Durch direkte Vergleiche der Biosyntheseleistung der isolierten Bakterien mit kommerziell erhältlichen Referenzstämmen wurde im Fall von Pseudomonas frederiksbergensis gezeigt, dass sich Bodenisolat und zugeordneter Referenz-stamm gegensätzlich enantioselektiv verhalten. Weitere Charakterisierungs-sonden (Farb- und Assimilationsreaktionen, Oberflächenfettsäureverteilung, „Siderophore-Typing“ und direkter rRNA Vergleich) sicherten die Zugehörigkeit beider Bakterienstämme als Pseudomonas frederiksbergensis-Spezies; keinerlei Unterschiede wurden zwischen den beiden Stämmen festgestellt. Zum ersten Mal werden somit zwei natürliche, nicht genetisch manipulierte Stämme von Pseudomonas frederiksbergensis beschrieben, deren Enzymaktivität eine entgegengesetzte Enantioselektivität in der mikrobiellen `whole-cell´ asym-metrischen Sulfoxidation aufweist. 4. In einem umfangreichen Substratscreening sind strukturvariierte organische Sulfide als Substrate zur bakteriellen Sulfoxidation eingesetzt worden. Anhand der ee-Werte wurde der Einfluss der Sulfidstruktur auf den Reaktionsverlauf bestimmt. Generell erwiesen sich Arylalkylsulfide als optimale Substrate für die bakterielle Sulfoxidation mit den isolierten und kommerziell erworbenen Stämmen von Arthrobacter aurescens und Pseuodomonas frederiksbergensis; aliphatische Sulfide wurden zur biokatalytischen Umsetzung nicht akzeptiert. 4a. Elektronenreiche para-Substituenten am Arylsystem ergaben teilweise enantio-merenreine Sulfoxide. 4b. Eine zunehmende Anzahl an Stickstoffatomen im Arylring (N-heterozyklische Grundstruktur) führte zu einer dramatischen Verringerung des ee-Wertes. 4c. Schwefelhaltige Furfuryle und Thiophene wurden nicht als Substrate für die enantioselektive Sulfoxidation akzeptiert. 4d. Der Einsatz schwefelhaltiger Pestizide in der Biokatalyse verlief erfolglos, allerdings wurden die Organophosphorpestizide Fenamiphos® und Fenthion® mit dem aus Sulfoxidationsreaktionen lange bekannten Enzym Chlorperoxidase (CPO) enantiomerenangereichert umgesetzt. 4e. Die biotechnologisch wichtige Anwendung der asymmetrischen Sulfoxidation in der Arzneistoffsynthese -hier versucht mit den Wirkstoffen Omeprazol® und Modafinil®- schlug fehl. 5. Der Einsatz eines Bioreaktors (Fermenter) schuf die Grundlage für künftige asymmetrrische Sulfoxidationen in präparativem Maßstab. Eine Zellzahlstudie mit Pseudomonas frederiksbergensis wurde durchgeführt; ferner erfolgten Bestimmungen der optimalen Fermentationsparameter am Beispiel einfach strukturierter, organischer Sulfide inklusive Blindwerts- und Hemmversuchen. Die toxischen Einflüsse auf die bakteriellen `whole-cell´-Systeme, die vom eingesetzten Sulfid sowohl als auch vom produzierten Sulfoxid verursacht werden, bedürfen besonderer Beachtung bei einer weiteren Bearbeitung dieses Themas. Das vorgestellte, neue Phänomen der asymmetrischen Sulfoxidation mit entgegenge-setzter Enantioselektivität durch zwei geno- und phänotypisch identische Spezies von Pseudomonas frederiksbergensis rechtfertigt eine weitere, intensive Suche nach derartigen, natürlichen Mikroorganismen.…
• The goal of this study was to employ intact microorganisms for the asymmetric synthesis of optically active sulfoxides from organic sulfides. Especially the efficient and convenient conditions of the so-called `whole-cell´ transformations, compared to the elaborate and costly reactions with isolated enzymes, provided the incentives and impetus for the present efforts in the steadily growing and future-oriented field of bioorganic chemistry. The highlights of these studies are enumerated briefly below: 1. The microorganisms were isolated,The goal of this study was to employ intact microorganisms for the asymmetric synthesis of optically active sulfoxides from organic sulfides. Especially the efficient and convenient conditions of the so-called `whole-cell´ transformations, compared to the elaborate and costly reactions with isolated enzymes, provided the incentives and impetus for the present efforts in the steadily growing and future-oriented field of bioorganic chemistry. The highlights of these studies are enumerated briefly below: 1. The microorganisms were isolated, singularized and cultivated. A soil sample served as source for the manifold bacteria, yeasts and fungi, which were tested for their efficacy of enantioselectively sulfoxidizing phenyl methyl sulfide as the standard model substrate. 2. A total of six microorganisms were genotypically characterized by standard methods and assigned to the corresponding species. The two bacterial strains with the highest enantiomeric excess (ee value) in the sulfoxidation, namely Arthrobacter aurescens (which forms the S enantiomer) and Pseudomonas frederiksbergensis (which forms the R enantiomer), were used for the prospective biosynthetic experiments. Pseudomonas frederiksbergensis was the only strain which produced preferentially the R enantiomer. 3. Direct comparison of the biosynthetic performance of the isolated bacteria with commercially available reference strains revealed that Pseudomonas frederiksbergensis (the isolated soil strain) displayed an opposing sense in the enantioselectivity than the reference strain. Further characterization tests (color and assimilation reactions, surface fatty acid spectra, siderophore typing and direct rRNA comparison) secured that both bacterial strains belong to the Pseudomonas frederiksbergensis species, since no differences whatsoever were found between both strains. Thus, for the first time two natural, genetically not manipulated strains of Pseudomonas frederiksbergensis are reported, which possess an opposing sense in the enantioselectivity for the microbial `whole-cell´ asymmetric sulfoxidation. 4. In an extensive substrate screening, a variety of organic sulfide structures was submitted to the bacterial asymmetric sulfoxidation. On the basis of the ee values, the influence of the sulfide structure on the course of the reaction was assessed. Generally speaking, the aryl alkyl sulfides proved to be optimal substrates for the bacterial sulfoxidation by the isolated and commercially available strains of Arthrobacter aurescens and Pseudomonas frederiksber-gensis; aliphatic sulfides were not accepted in biocatalytic enantioselective conversions. Specifically, the following trends obtain: 4a. Electron-rich para substituents on the aryl system afforded enantiomerically pure sulfoxides. 4b. An increasing number of nitrogen atoms in the aryl ring (N-heterocyclic structure) led to a dramatic decrease of the ee values. 4c. Sulfur-containing furfurals and thiophenes were not accepted in the present enantioselective sulfoxidation. 4d. The use of sulfur-containing pesticides as substrates in the biocatalysis failed, but the phosphor-containing organic pesticides Fenamiphos® and Fenthion® were converted to the respective enantiomerically enriched sulfoxides by chloroperoxidase (CPO), an enzyme known to catalyze asymmetric sulfoxidation. 4e. The application of the biotechnologically important asymmetric sulfoxidation in drug synthesis -in particular the pharmaceutical agents Omeprazol® and Modafinil®- failed. 5. The use of a fermenter established the basis for future asymmetric sulfoxidations on a preparative scale. A cell-count study with Pseudomonas frederiksbergensis was conducted and the fermentation parameters were optimized with simple organic sulfides by employing blanks and inhibition tests. The toxicity of the sulfide substrate and the sulfoxide product on the bacterial `whole-cell´ systems demands particular attention in future work. The new phenomenon of asymmetric sulfoxidation by the two genotypically and phenotypically identical species of Pseudomonas frederiksbergensis displays an opposing sense in the enantioselectivity, which encourages to search intensively for other such natural microorganisms.…