Ulrich Käppler

• Cystein-Proteasen sind in eine Vielzahl physiologischer und pathophysiologischen Prozesse involviert. Auch bei humanpathogenen Parasiten sind sie weit verbreitet und für das Überleben der Erreger essentiell. Substanzen, die diese Proteasen hemmen, könnten daher bei vielen Indikationen als neue Arzneistoffe eingesetzt werden. In der vorliegenden Arbeit wurden nichtpeptidische Cystein-Proteaseinhibitoren synthetisiert, die als elektrophile Gruppe ein a,b-ungesättigtes Keton enthalten, und den Cysteinrest im aktiven Zentrum der Proteasen in einerCystein-Proteasen sind in eine Vielzahl physiologischer und pathophysiologischen Prozesse involviert. Auch bei humanpathogenen Parasiten sind sie weit verbreitet und für das Überleben der Erreger essentiell. Substanzen, die diese Proteasen hemmen, könnten daher bei vielen Indikationen als neue Arzneistoffe eingesetzt werden. In der vorliegenden Arbeit wurden nichtpeptidische Cystein-Proteaseinhibitoren synthetisiert, die als elektrophile Gruppe ein a,b-ungesättigtes Keton enthalten, und den Cysteinrest im aktiven Zentrum der Proteasen in einer Michael-Reaktion addieren. Als Leitstruktur diente das Diuretikum Etacrynsäure, dessen Struktur an verschiedenen Positionen modifiziert wurde. Der Hauptsyntheseweg kann wie folgt beschrieben werden: Die Acylseitenkette gewünschter Kettenlänge wurde durch Friedel-Crafts-Acylierung in entsprechend substituierte Anisole eingeführt. Diese wurden in einer unmittelbar anschließenden Reaktion zu acylierten Phenolen gespalten, die in einem Folgeschritt mit Bromessigsäureethylester zu acylierten Phenoxyessigsäureethylestern verethert wurden. In diese wurde in a-Position zum Keton eine Doppelbindung eingeführt. Über eine Mannich-Reaktion mit N,N,N’,N’-Tetramethyldiaminomethan/Acetanhydrid oder Urotropin/Acetanhydrid erhält man so die acylierten Phenoxyessigsäureethylester mit a,b-ungesättigter Ketonstruktur. Zur Darstellung der entsprechenden ungesättigten Säuren aus den acylierten Phenoxyessigsäureethylestern bedient man sich einer basenkatalysierten Aldokondensation mit Formaldehyd, unter deren Bedingungen der Ethylester zur Säure gespalten wird. Kupplung von Etacrynsäure mit Aminen unter Aktivierung mit DCC/N-Hydroxysuccinimid führte zu den Etacrynsäureamiden. Methylierung der acylierten Phenole und anschließende Mannich-Reaktion dient der Darstellung der acylierten Anisole mit a,b-ungesättigter Ketonstruktur. Auf diesem Syntheseweg wurden 28 Derivate mit Michael-System synthetisiert. Diese wurden an den Cystein-Proteasen Papain, Cathepsin B (CB), Falcipain (FP) und Rhodesain (RD) getestet. Gegen Serin-Proteasen wurde keine Hemmung festgestellt. Die meisten Inhibitoren zeigten bei CB, FP und RD eine nicht-zeitabhängige Kinetik der Enzyminaktivierung. Nur bei Papain wurde eine zeitabhängige Kinetik beobachtet. Die Substanzen wurden zwar als irreversible Inhibitoren konzipiert, Dialyseversuche beweisen jedoch eine reversible Hemmung. Da eine Vergleichssubstanz ohne aktivierte Doppelbindung unwirksam ist, kann von einer kovalenten Reaktion mit den Cystein-Proteasen ausgegangen werden. Bestimmt wurden die Dissoziationskonstanten Ki der Enzym-Inhibitor-Komplexe EI als Maß für die Affinitäten der Inhibitoren zum Enzym und, soforn möglich, auch die Alkylierungsgeschwindigkeitskonstanten ki der Reaktion zu modifiziertem Enzym E-I. Eine allgemeine Selektivität für einzelne Enzyme konnte nicht gefunden werden. Die besten Inhibitoren (Ki = 3.2 - 57.5 µM) waren die Etacrynsäureamide. Die Analyse der Struktur-Wirkungs-Beziehungen ergab, dass wie erwartet das a,b-ungesättigte System essentiell für die Wirksamkeit an Cystein-Proteasen ist, ebenso ein aromatischer Ring. Eine längere Seitenkette an der Doppelbindung, die mindestens einen Ethylrest trägt, sowie zwei benachbarte Halogenatome am aromatischen Ring erwiesen sich als wirkungssteigernd. Ester und Amide zeigten generell bessere Hemmeigenschaften als die freien Säuren. Methoxy-Gruppen am Aromaten hatten keinen Wirkungsverlust zur Folge, senken aber die Löslichkeit in wässrigem Medium. Viel versprechend ist auch der [5-Chlor-2-(2-methylenbutyryl)-phenoxy]-essigsäureethylester, der das a,b-ungesättigte Doppelbindungs-System in ortho-Position zum phenolischen Sauerstoffatom trägt. Innerhalb der Amide sind kurze, voluminöse Reste wie der tertButylrest von Vorteil, eine gewisse Selektivität wird mit langkettigen Amiden wie dem n-Hexylamid für FP gegenüber CB und RD erreicht. Die Verbindungen wurden auf die Wachstumshemmung von grampositiven und gramnegativen Problemkeimen, sowie auf die Hemmung der Biofilmbildung grampositiver Erreger getestet. Bei gramnegativen Keimen wurde das Wachstum nicht gehemmt. Bei den grampositiven Keimen Staphylococcus aureus und S. epidermidis wirkten ebenfalls der Etacrynsäureethylester und das Hexylamid, Benzylamid, Anilid der Etacrynsäure am besten (MHK = 5 - 20 µM). Die genannten Verbindungen zeigten auch die stärkste Hemmwirkung auf die Biofilmbildung (100 % bei 20 - 40 µM bis zu 95 % bei 2.5 - 5 µM an S. aureus). Aufgrund positiver Screeningergebnisse in einem enzymatischen HPLC-Assays an der humanen SARS-Coronavirus Hauptprotease (SARS-CoV Mpro) wurden Docking-Experimente mit Etacrynsäure-tertbutylamid an der humanen SARS-Coronavirus Hauptprotease (SARS-CoV Mpro) durchgeführt. Die Ergebnisse führten zur Synthese einer modifizierten Verbindung, die eine geringe Verbesserung der Enzyminhibition im fluorimetrischen Assay zeigte.…
• Cysteine proteases are involved in a variety of physiological and pathophysiological processes. They are wide-spread in pathogenic parasites as well and are essential for the survival of the pathogens. Compounds which inhibit these proteases could serve as new pharmaceuticals for many therapeutic indications. In the present work non-peptidic cysteine protease inhibitors, which contain an a,b-unsaturated ketone as electrophilic group and which are able to add the cysteine residue of the proteases’ active site in a Michael-type reaction, wereCysteine proteases are involved in a variety of physiological and pathophysiological processes. They are wide-spread in pathogenic parasites as well and are essential for the survival of the pathogens. Compounds which inhibit these proteases could serve as new pharmaceuticals for many therapeutic indications. In the present work non-peptidic cysteine protease inhibitors, which contain an a,b-unsaturated ketone as electrophilic group and which are able to add the cysteine residue of the proteases’ active site in a Michael-type reaction, were synthesized. The diuretic etacrynic acid was used as lead compound, its structure was modified in several positions. The main synthetic pathway is as follows: the acyl side chain of the desired length was introduced in correspondingly substituted anisoles via a Friedel-Crafts acylation. The yielded acylated anisols were cleaved to the acylated phenols in a consecutive reaction. They were transferred to the acylated phenoxy acetic acid esters in a following step with bromo acetic acid ethyl ester. A double bond was introduced into the acylated phenoxy acetic acid esters in a-position of the ketone. The acylated phenoxy acetic acid ethyl esters with an a,b-unsaturated ketone moiety are yielded via a Mannich reaction with N,N,N’,N’-tetramethyl-diaminomethane/acetic acid anhydride or urotropine/acetic acid anhydride. To synthesize the corresponding unsaturated acids out of the acylated phenoxy acetic acid esters a base-catalyzed aldol condensation with formaldehyde in aqueous ethanol is used. Under these conditions the ethyl ester is cleaved to give the free acid. Coupling of etacrynic acid with amines by activation with DCC/N-hydroxy succinic imide led to the etacrynic acid amides. Methylation of the acylated phenols and consecutive Mannich reaction, as described above, leads to the acylated anisols with a,b-unsaturated ketone moiety. Following this synthetic pathway 28 derivatives with a Michael system were synthesized. These compounds were tested in the cysteine proteases papain, cathepsin B (CB), falcipain (FP) and rhodesain (RD). No inhibition of serine proteases was detected. Most of the inhibitors showed non-time-dependent kinetics for enzyme inactivation of CB, FP and RD. Only with papain time-dependent kinetics are observed. Although the compounds were planned as irreversible inhibitors, dialysis assays proved a reversible inhibiton. Since a comparative compound without a double bond is inactive, a covalent reaction with the cystein proteases can be assumed. Dissociation constants Ki of the enzyme-inhibitor-complexes EI were determined as a measurement of the affinities of the inhibitors towards the enzymes, as well as the alkylation velocity constants ki of the reaction yielding the modified enzyme E-I. The latter could be determined only in cases of a time-dependent inhibition. A general selectivity for single enzymes could not be found. The etacrynic acid amides were the best inhibitors (Ki = 3.2 - 57.5 µM). The analysis of the structure-activity relationship showed, as expected, the a,b-unsaturated system being essential for activity in cysteine proteases. The same fact is true for the aromatic ring. A longer side chain next to the double bond, which contains at least an ethyl moiety, as well as two vicinal halogen atoms at the aromatic ring proved to enhance the activtity of the inhibitors. Generally, esters and amides showed better inhibition properties than the free acids. Methoxy groups at the aromatic ring did not result in a loss of inhibition but in a reduced solubility in aqueous media. Compound [5-Chloro-2-(2-methylenebutyryl)-phenoxy]-acetic acid ethyl ester, which carries the a,b-unsaturated double bond system in ortho position to the phenolic oxygen atom, is also promising. Within the amides short voluminous moieties such as the tertbutyl moiety are advantageous. A distinct selectivity for FP against CB and RD can be achieved with long-chain amides such as the n-hexyl amide. The compounds were examined for growth inhibition of gram-positive and gram-negative pathogens as well as for inhibition of biofilm formation of gram-positive pathogens. The growth of gram-negative germs was not inhibited. The gram-positive germs Staphylococcus aureus and S. epidermidis were inactivated best by etacrynic acid ethyl ester and by the n-hexyl amide, the benzyl amide and the anilide of etacrynic acid (MHK = 5 - 20 µM). The mentioned compounds also showed the highest inhibition rate for biofilm formation (100 % at 20 - 40 µM to 95 % at 2.5 - 5 µM in S. aureus). Due to positive screening results in a enzymatic HPLC-assay of human SARS coronavirus main protease (SARS-CoV Mpro) docking experiments were conducted on etacrynic acid tertbutyl amide. The results led to the synthesis of a modified compound which showed weak improvement of enzyme inhibition in a fluorimetric assay.…