Adrien Daigeler

• Das Endothel verfügt im wesentlichen über drei dynamische Funktionseinheiten zur Migration und Zellkontaktbildung: Ein intrazelluläres Gerüst, bestehend einerseits aus den sogenannten Stressfasern, welche die Zelle durchziehen und vornehmlich an Zell-Zell-Kontakten und Zell-Matrix-Kontakten anhaften und so der Zelle Stabilität geben, und andererseits aus kontraktilen Aktin-Myosinbündeln, welche die Zelle befähigen, sich fortzubewegen oder ihre Form zu ändern, beispielsweise Ausläufer zu bilden. Zell-Zell-Kontakte, die es den Zellen ermöglichen,Das Endothel verfügt im wesentlichen über drei dynamische Funktionseinheiten zur Migration und Zellkontaktbildung: Ein intrazelluläres Gerüst, bestehend einerseits aus den sogenannten Stressfasern, welche die Zelle durchziehen und vornehmlich an Zell-Zell-Kontakten und Zell-Matrix-Kontakten anhaften und so der Zelle Stabilität geben, und andererseits aus kontraktilen Aktin-Myosinbündeln, welche die Zelle befähigen, sich fortzubewegen oder ihre Form zu ändern, beispielsweise Ausläufer zu bilden. Zell-Zell-Kontakte, die es den Zellen ermöglichen, fest aneinander zu haften und sich so einerseits gegenseitig zu stützen und andererseits eine regulierbare Barriere zwischen intravasalem Raum und Interstitium zu bilden. Zell-Matrix-Kontakte, welche die Zelle fest mit dem Untergrund verankern und ein Unterspülen der Zelle verhindern. Besonders während der Migration der Endothelzelle unterliegen diese Systeme ständigem Auf- und Abbau. Diese Funktionseinheiten werden durch Rho-Proteine reguliert. Man unterscheidet drei wichtige Vertreter dieser Gruppe: Rac, CDC42 und RhoA. Es wurde die Prenylierung von Proteinen und damit auch die Prenylierung von Rho-Proteinen durch den HMG-CoA-Reduktase-Hemmer Lovastatin unterdrückt. In einer zweiten Versuchsserie wurden alle Rho-Proteine unselektiv durch Toxin-B, einem Toxin aus Clostridium difficile, und anschließend selektiv RhoA durch C3-Toxin aus Clostridium botulinum inaktiviert. Es wurden die Effekte auf Primärkulturen von Endothelzellen aus dem Truncus pulmonalis des Schweins, besonders im Hinblick auf Migration, Stressfasersystem, Zell-Zell- und Zell-Matrix-Kontakte, mit Hilfe immuncytochemischer Methoden beobachtet. Es konnte gezeigt werden, daß die Rho-Proteine wesentlich für die Bildung von Zellausläufern, wie zum Beispiel Lamellopodien, und die Migration in Endothelzellen sind. Zudem konnte belegt werden, daß Aufbau und Aufrechterhaltung des Aktinfilamentsystems und des kontraktilen Apparates der Endothelzellen im wesentlichen über das geranylierte RhoA reguliert werden. Die Effekte der unselektiven Rho-Protein-Hemmung unterschieden sich hier kaum von denen der selektiven RhoA-Hemmung. Auch die Unterdrückung der Geranyl-Prenylierung zeigte vergleichbare Ergebnisse. Die Aufrechterhaltung der Zell-Zell-Kontakte ist allerdings RhoA-unabhängig, da es trotz selektiver RhoA-Hemmung durch C3-Toxin nicht zur Auflösung der Zell-Zell-Kontakte kam. Diese werden vielmehr über Rac und/oder CDC42 gesteuert, denn erst durch die Blockierung aller Rho-Proteine durch Toxin-B kam es zur Lückenbildung zwischen den Zellen. Auch hier spielt die Geranylierung der Rho-Proteine eine wichtige Rolle, da die Geranylierungshemmung ähnliche Effekte wie die Hemmung durch Toxin-B zeigte. Die Ausbildung und Aufrechterhaltung der Fokalkontakte erfolgt im wesentlichen auch über die geranylierten Rho-Proteine, wobei RhoA hier die entscheidende Rolle zuzukommen scheint. Somit konnte in dieser Arbeit die entscheidende Rolle der Rho-Proteine und im speziellen die des RhoA-Proteins bei der Regulation wesentlicher Funktionseinheiten der Endothelzelle aufgezeigt werden.…
• The effects of Lovastatin, Clostridium difficile toxin B and Clostridium botulinum toxin C3 on endothelial cells of porcine pulmonary trunk were analized. Lovastatin is a well known hydroxymethylglutaryl coenzyme A (HMG-CoA) reductase inhibitor, that prevents isoprene synthesis and thereby lipid modification of Rho proteins carboxy terminus, which is essential for membrane association and activation. Toxin B, the causative agent of antibiotic associated pseudomembraneous colitis, inactivates the Rho proteins Rho, Rac and CDC 42 byThe effects of Lovastatin, Clostridium difficile toxin B and Clostridium botulinum toxin C3 on endothelial cells of porcine pulmonary trunk were analized. Lovastatin is a well known hydroxymethylglutaryl coenzyme A (HMG-CoA) reductase inhibitor, that prevents isoprene synthesis and thereby lipid modification of Rho proteins carboxy terminus, which is essential for membrane association and activation. Toxin B, the causative agent of antibiotic associated pseudomembraneous colitis, inactivates the Rho proteins Rho, Rac and CDC 42 by glucolysation. C3 toxin, the causative agent of botulism, selectively inactivates Rho by adenosine diposhate ribosylation. Effects of these inhibitors on migration, stressfibres, adherens junctions and focal adhesions were observed by immunocytochemical means and interpreted with regard to their dependency on Rho proteins. Results: Prenylation of Rho proteins is essential for maintainance as well as for rearrangement of the filamentous actin system and migration in porcine endothelial cells. Toxin B, that inhibits Rho, Rac and CDC42 prevented migration completely. Injection of C3-toxin TRITC-Phalloidin staining revealed a complete breakdown of filamentous actin in endothelial cells. Polymerization as well as maintainance of filamentous actin is dependent on prenylated Rho proteins, especially Rho. Treatment of endothelial cells with Lovastatin did not have an evident effect on distribution of Catenins. The prenylation of Rho proteins seems to be not essential for keeping mature adherens junctions intact. Treatment with toxin B induced a disruption of adherens junctions. Catenins and VE-Cadherin were arranged discontinuous between adjacent cells. Large gaps between resting and migrating cells developed. Selective inhibition of Rho by injection of C3 toxin did not cause a change in Catenin or VE-Cadherin distribution. Therefore we conclude that not Rho, but Rac or CDC42 are necessary to uphold continuity of cell contacts. Focal adhesions were reduced under Lovastatin treatment. Toxin B and C3-toxin prevented assembly and maintainance of focal adhesion contacts. Therefore we conclude that Rho plays the crucial role for focal adhesion regulation in endothelial cells.…