Jannic Böhm

• Der transkriptionelle Koaktivator BOB.1/OBF.1 spielt eine wichtige Rolle in der oktamer-abhängigen Transkription in B-Lymphozyten. Mäuse, denen dieser Koaktivator fehlt, zeigen verschiedene Defekte in der B-Zellentwicklung. Besonders auffällig ist hierbei das völlige Fehlen der Keimzentren. Übereinstimmend mit diesem Phänotyp zeigten B-Zellen des Keimzentrums eine stark erhöhte BOB.1/OBF.1-Expression im Vergleich zu ruhenden B-Zellen. Im Gegensatz zu primären B-Zellen unterschiedlicher Entwicklungsstadien zeigen transformierte korrespondierendeDer transkriptionelle Koaktivator BOB.1/OBF.1 spielt eine wichtige Rolle in der oktamer-abhängigen Transkription in B-Lymphozyten. Mäuse, denen dieser Koaktivator fehlt, zeigen verschiedene Defekte in der B-Zellentwicklung. Besonders auffällig ist hierbei das völlige Fehlen der Keimzentren. Übereinstimmend mit diesem Phänotyp zeigten B-Zellen des Keimzentrums eine stark erhöhte BOB.1/OBF.1-Expression im Vergleich zu ruhenden B-Zellen. Im Gegensatz zu primären B-Zellen unterschiedlicher Entwicklungsstadien zeigen transformierte korrespondierende B-Zellen keine Regulation der BOB.1/OBF.1-Expression. T-Zellen exprimieren im Gegensatz dazu BOB.1/OBF.1 erst nach Stimulation mit PMA und Ionomycin. Um die unterschiedliche Regulation in B-Zellen versus T-Zellen zu untersuchen wurde der BOB.1/OBF.1-Promotor kloniert. Die Analyse der Promotor-Sequenz ergab Bindungsstellen für die Transkriptionsfaktoren CREB, NF-AT und ein SRY-Motiv. In Transfektionsstudien konnte eine deutliche Zellspezifität des Promotors gezeigt werden. Die erwartete induzierbare Aktivierung in T-Zellen war hingegen nur schwach. Die Analyse der BOB.1/OBF.1-Regulation in B-Zellen des Keimzentrums ergab, daß die verstärkte BOB.1/OBF.1-Expression nur partiell auf eine erhöhte Expression des BOB.1/OBF.1-Transkriptes zurück zu führen ist. Vielmehr zeigte sich eine deutliche Regulation des BOB.1/OBF.1-Proteins. In einem "yeast-two hybrid screen" mit der amino-terminalen Domäne von BOB.1/OBF.1 als "bait" (Köder) konnten die beiden Proteine SIAH1 und SIAH2 als Interaktionspartner identifiziert werden. Eine beschriebene Funktion von SIAH1 und SIAH2 liegt in der Regulation der Proteinstabilität ihrer Interaktionspartner. In Ko-Transfektionsexperimenten konnte gezeigt werden, daß SIAH1 die BOB.1/OBF.1-Proteinstabilität vermindert, ohne die transkriptionelle Expression zu beeinflussen. Die Inhibition des Proteasoms führt hierbei zu einer stark verminderten BOB.1/OBF.1-Degradation. Abschließend konnte gezeigt werden, daß die Aktivierung des B-Zellrezeptors zu einer Degradation von BOB.1/OBF.1 durch SIAH1 führt und folglich die transkriptionelle Aktivierung BOB.1/OBF.1-abhängiger Reporterkonstrukte vermindert wird. In einem zweiten "yeast-two hybrid screen" mit der carboxy-terminalen Domäne von BOB.1/OBF.1 als "bait", konnten die Interaktionspartner ABP 280 und Mcm7 identifiziert werden. Besonders die Rolle von Mcm7 in der Transkription könnte neue Aufschlüsse über die Wirkungsweise des transkriptionellen Aktivators BOB.1/OBF.1 geben.…
• The BOB.1/OBF.1 coactivator is critically involved in mediating octamer-dependent transcriptional activity in B lymphocytes. Mice lacking this coactivator show various defects in B cell development most notably they completely lack germinal centers. Consistent with this phenotype, BOB.1/OBF.1 levels are massively upregulated in germinal center B cells as compared to resting B cells. In contrast to primary B cells, all transformed B cell lines express BOB.1/OBF.1 in comparable amounts. In T cells, BOB.1/OBF.1 expression can be induced byThe BOB.1/OBF.1 coactivator is critically involved in mediating octamer-dependent transcriptional activity in B lymphocytes. Mice lacking this coactivator show various defects in B cell development most notably they completely lack germinal centers. Consistent with this phenotype, BOB.1/OBF.1 levels are massively upregulated in germinal center B cells as compared to resting B cells. In contrast to primary B cells, all transformed B cell lines express BOB.1/OBF.1 in comparable amounts. In T cells, BOB.1/OBF.1 expression can be induced by stimulation with PMA and ionomycin. To analyse the different regulation in B cells versus T cells, I cloned the BOB.1/OBF.1 promoter. Analyses of the promoter sequence showed binding sites for the transcription factors CREB, NF-AT and SRY/SOX-protein. Transfection experiments revealed a clear cell type specificity of the promoter. However the promoter was only poorly inducible in stimulated T-cells. I have addressed the mechanism of BOB.1/OBF.1 upregulation in germinal center B cells and found that only a minor part of this regulation can be attributed to increased levels of BOB.1/OBF.1-specific mRNA. Apparently, BOB.1/OBF.1 is also regulated at the protein level. In support of this suggestion I have been able to identify two related BOB.1/OBF.1 interacting proteins, SIAH1 and SIAH2, in a yeast two-hybrid screen using the amino-terminal domain as "bait". SIAH1 and SIAH2 are known regulators of protein stability. Cotransfection experiments revealed that coexpression of SIAH results in a destabilisation of BOB.1/OBF.1 protein without affecting mRNA levels. Furthermore, proteasome inhibitors block the degradation of BOB.1/OBF.1 protein. Finally B cell receptor cross-linking also resulted in the degradation of BOB.1/OBF.1 via SIAH1 and consequently reduced transcriptional activation of BOB.1/OBF.1-dependent reporters. Using the carboxy-terminal domain of BOB.1/OBF.1 as "bait", I identified in a second yeast-two hybrid screen the proteins ABP 280 and Mcm7 as potential interaction partners. Especially the role of Mcm7 in transcription could give new insights as to how BOB.1/OBF.1 is able to function as a transcriptional activator.…