Peter Staib

• Der opportunistisch humanpathogene Hefepilz Candida albicans gehört bei vielen gesunden Menschen zur mikrobiellen Schleimhautflora, kann jedoch bei abwehrgeschwächten Patienten oberflächliche Infektionen sowie auch lebensbedrohliche tiefe Organmykosen verursachen. Obwohl der Immunstatus des Wirtes für eine Infektion mit diesem Erreger von entscheidender Bedeutung ist, tragen vermutlich auch eine Reihe von Virulenzfaktoren zur Pathogenität von C. albicans bei, indem sie Besiedlung, Ausbreitung und Vermehrung der Pilzzellen unter Anpassung an dieDer opportunistisch humanpathogene Hefepilz Candida albicans gehört bei vielen gesunden Menschen zur mikrobiellen Schleimhautflora, kann jedoch bei abwehrgeschwächten Patienten oberflächliche Infektionen sowie auch lebensbedrohliche tiefe Organmykosen verursachen. Obwohl der Immunstatus des Wirtes für eine Infektion mit diesem Erreger von entscheidender Bedeutung ist, tragen vermutlich auch eine Reihe von Virulenzfaktoren zur Pathogenität von C. albicans bei, indem sie Besiedlung, Ausbreitung und Vermehrung der Pilzzellen unter Anpassung an die verschiedensten Wirtsnischen unterstützen. Eine für die Pathogenität von C. albicans wichtige Eigenschaft ist die Bildung sekretorischer Aspartylproteasen (SAPs), die durch eine große Familie homologer Gene codiert werden. Es wird angenommen, dass die individuellen Proteasen während der Infektion verschiedene Aufgaben erfüllen bzw. optimal an unterschiedliche Wirtsnischen angepaßt sind. Jedoch ist der Beitrag der einzelnen SAP-Gene zur Pathogenese noch weitgehend unverstanden. Da die wirtsinduzierte Aktivierung dieser Virulenzgene während bestimmter Infektionsstadien Hinweise auf ihre spezifische pathogenetische Bedeutung liefern könnte, wurde in dieser Arbeit eine Methode für C. albicans entwickelt, mit der die Induktion eines Gens während der Infektion nachgewiesen werden kann. Die Methode beruht auf einer genetischen Rekombination als Reporter einer Genexpression, was bedeutet, dass nach Induktion des zu untersuchenden Gens eine site-spezifische Rekombinase spezifisch einen Mykophenolsäure-Resistenzmarker aus dem Genom der Zelle entfernt. Da diese Deletion ein irreversibles Ereignis darstellt, das auf die jeweiligen Nachkommen vererbt wird, kann selbst eine vorübergehende Genaktivierung während eines bestimmten Infektionsstadiums bzw. in einem bestimmten Organ in einzelnen Zellen nach deren Reisolierung aus infiziertem Gewebe durch Ausplattieren auf geeignetem Indikatormedium nachgewiesen werden. Durch Analyse der Expression des SAP2-Gens wurde bestätigt, dass mit diesem Reportersystem eine biologisch signifikante Genaktivierung in C. albicans nachgewiesen werden kann. SAP2 wird in C. albicans in vitro in einem Medium induziert, das Rinderserumalbumin als alleinige Stickstoffquelle enthält, ist in anderen gängigen Labormedien jedoch reprimiert. Diese in vivo-Expressionstechnologie (IVET) wurde verwendet, um die Expression von sechs verschiedenen SAP-Genen von C. albicans, SAP1-SAP6, in unterschiedlichen Tiermodellen zu studieren. Dabei konnte gezeigt werden, dass die einzelnen Proteasegene abhängig von der Art der Infektion, d.h. lokal begrenzte Schleimhautinfektion bzw. Systeminfektion, und auch vom Infektionsstadium differentiell reguliert werden. Dabei wurden sogar die äußerst homologen Gene SAP4-SAP6, die aufgrund von in vitro erzielten Ergebnissen als hyphenspezifische Gene galten, in vivo unterschiedlich reguliert. SAP5 und SAP6, aber nicht die anderen SAP-Gene, wurden in einem Maus-Ösophagus-Schleimhautmodell signifikant aktiviert, als die C. albicans-Hyphen in das Epithel invadierten. Eine stadienspezifische Expression der SAP-Gene wurde in einem Maus-Peritonitis-Modell beobachtet. Kurz nach Inokulation der C. albicans-Hefezellen in die Bauchhöhle der Tiere, zu einem Zeitpunkt, als noch keine Ausbildung von Hyphen zu beobachten war, wurde SAP5, aber nicht SAP6 oder eines der anderen analysierten SAP-Gene in einem signifikanten Anteil der infizierenden Zellen aktiviert. Demzufolge scheint SAP5 für die Gewebeinvasion während der Schleimhautinfektion und auch für die ersten Schritte während einer disseminierenden Infektion von Bedeutung zu sein. Durch die intravenöse Infektion der Maus, bei der frühe Infektionsschritte umgangen werden, wurde gezeigt, dass SAP5 und SAP6, aber auch SAP4, während der späteren Stadien einer disseminierenden Infektion weiterhin aktiviert werden. Dagegen wurde eine Induktion des SAP2-Gens vorwiegend im Spätstadium einer systemischen Infektion beobachtet, nachdem die Pilzzellen innere Organe befallen hatten. Daher fördert SAP2 vermutlich weniger die Invasion von Geweben, dafür aber die Vermehrung der Pilze nach Organbefall, möglicherweise durch die Bereitstellung von Nährstoffen. Dabei wurde gezeigt, dass die in vivo-Regulation von SAP2 durch bestimmte Repeatstrukturen innerhalb der Promotorregion dieses Gens beeinflußt wird. Während des Verlaufs einer systemischen Infektion wurden sogar die zwei SAP2-Allele des hier untersuchten C. albicans-Modellstammes CAI4, die sich in dieser Repeatregion unterscheiden, differentiell reguliert. Das SAP2-2-Allel wurde nämlich bereits deutlich früher induziert als das Allel SAP2-1. Eine Expression von SAP1 und SAP3 konnte im Gegensatz zu den anderen SAP-Genen nur in wenigen der infizierenden Zellen nachgewiesen werden, so dass diesen Genen ein Beitrag zur Pathogenität in den hier untersuchten Infektionsmodellen nicht beigemessen werden kann. Im Verlauf einer Infektion setzt C. albicans vermutlich viele verschiedene Virulenzfaktoren gleichzeitig für eine bestmögliche Anpassung an die jeweilige Wirtsnische ein. Ob in Abhängigkeit entsprechender Wirtssignale dabei unterschiedliche Eigenschaften der Pilzzelle koordiniert reguliert werden, ist kaum erforscht, erscheint jedoch für ein besseres Verständnis der Erreger-Wirts-Auseinandersetzung von besonderem Interesse. An der Kontrolle der Hyphenbildung von C. albicans sind wenigstens zwei Signaltransduktionskaskaden beteiligt, eine MAP-Kinase-Kaskade und ein cAMP-abhängiger Signalweg, die in den Transkriptionsregulatoren CPH1 bzw. EFG1 enden. Nachdem dimorphes Wachstum für die Infektion von Bedeutung ist und die Expression der Gene SAP4-SAP6 in vitro mit der Hyphenwachstumsphase verbunden ist, wurde eine mögliche Abhängigkeit hyphenassoziierter SAP-Aktivierung von diesen Regulatoren durch die Analyse der SAP5-Expression in entsprechenden Mutanten analysiert. Sowohl in cph1- als auch in efg1-Einzelmutanten wurde eine reduzierte Aktivierung des SAP5-Gens in vivo beobachtet. Dadurch konnte gezeigt werden, dass sowohl CPH1 als auch EFG1 zur SAP5-Aktivierung während der Infektion beitragen. Da cph1-Mutanten im infizierten Gewebe wie der Wildtyp-Stamm Hyphen ausbildeten, war die Hyphenbildung allein offensichtlich nicht für eine volle SAP5-Aktivierung in vivo ausreichend. Andererseits war die SAP5-Induktion in vivo nicht von der Hyphenwachstumsphase abhängig, da eine verminderte, aber dennoch signifikante SAP5-Expression auch in den efg1-Mutanten zu beobachten war, die in den infizierten Tieren nur in der Hefephase wuchsen. In Zellen, in denen beide Regulatoren fehlten, konnte eine Induktion von SAP5 kaum nachgewiesen werden. Das bedeutet, dass diese Signalwege in C. albicans für die Kontrolle verschiedener zellulärer Programme während der Infektion wichtig sind und die Expression von unterschiedlichen Virulenzgenen koordinieren. Durch die in vivo-Analyse der Virulenzgenexpression in C. albicans konnten Einblicke in regulatorische Anpassungsmechanismen dieses Mikroorganismus an verschiedene Wirtsnischen gewonnen werden. Einzelne Mitglieder einer Virulenzgenfamilie dieses Pilzes werden während der Infektion differentiell und in Abhängigkeit vom Infektionsstadium reguliert und tragen daher vermutlich sehr spezifisch zur Pathogenese bei. Unterschiedliche Virulenzmerkmale können zudem während der Infektion koordiniert reguliert werden und dadurch gemeinsam die Anpassungsfähigkeit von C. albicans an den Wirt unterstützen. Die erzielten Erkenntnisse sollten letztlich dazu beitragen, die Pathogenität dieses wichtigen opportunistisch humanpathogenen Erregers besser verstehen zu können.…
• The opportunistic human pathogenic yeast Candida albicans is a member of the microflora on mucosal surfaces of many healthy people but can cause superficial infections as well as life-threatening deep organ mycoses in immunocompromised patients. Although the ability of C. albicans to cause disease largely depends on the immune status of the host, it is generally assumed that a number of virulence factors also contribute to the pathogenicity of C. albicans, thereby supporting colonization, distribution and multiplication of the fungal cells andThe opportunistic human pathogenic yeast Candida albicans is a member of the microflora on mucosal surfaces of many healthy people but can cause superficial infections as well as life-threatening deep organ mycoses in immunocompromised patients. Although the ability of C. albicans to cause disease largely depends on the immune status of the host, it is generally assumed that a number of virulence factors also contribute to the pathogenicity of C. albicans, thereby supporting colonization, distribution and multiplication of the fungal cells and allowing an adaption to various host niches. The production of secreted aspartic proteases (SAPs), encoded by a large family of homologous genes, plays an important role in C. albicans pathogenicity. It is likely that the individual proteases fullfill various functions during infection or are optimally adapted to different host niches. However, the contribution of single SAP genes to pathogenicity is not well understood. Because the host-induced activation of these virulence genes at a certain infection stage might give clues to their specific role in pathogenicity, an in vivo-expression technology (IVET) was developed in this work that allows the detection of gene activation in C. albicans during infection. The method is based on genetic recombination as a reporter of gene expression, resulting in the specific excision of a mycophenolic acid resistance marker from the genome by a site-specific recombinase after induction of the target gene. Because deletion of the marker represents an irreversible event that is inherited by the progeny of the corresponding cell, even a transient gene expression at a certain infection stage or in specific organs can be detected in single cells recovered from infected tissue by plating on appropriate indicator medium. The suitability of the reporter system for detecting a biologically meaningful gene activation in C. albicans was confirmed by analyzing expression of the SAP2 gene, which is induced in vitro during growth in a medium containing bovine serum albumin as the sole nitrogen source, but repressed in other commonly used laboratory media. IVET was then used to analyze the in vivo expression of six different SAP genes of C. albicans, SAP1-SAP6, in various animal models. It could be demonstrated that the individual protease genes are indeed differentially regulated, depending on the type of the infection, i.e. locally restricted mucosal infection or systemic infection, and the stage of an infection. Even the highly homologous SAP4-SAP6 genes, which from the results of in vitro experiments had been supposed to be hyphae-specific genes, were differentially regulated in vivo. SAP5 and SAP6, but not the other SAP genes, were significantly activated in a mouse model of oesophageal candidiasis when C. albicans hyphae invaded into the epithelium. A stage-specific expression of SAP genes was observed in a mouse model of Candida peritonitis. Soon after inoculation of C. albicans yeasts into the peritoneal cavity, before hyphae formation was observed, SAP5 but not SAP6 or any of the other SAP genes analyzed was activated in a significant part of the infecting cell population. Therefore, SAP5 seems to be important for tissue invasion during mucosal infection and also during the initial steps of a disseminated infection. By intravenous inoculation of C. albicans into mice, thereby bypassing the early infection stages, it was demonstrated that expression of SAP5 and SAP6, but also SAP4, continued into the later stages of a disseminated infection. In contrast, an induction of the SAP2 gene was observed predominantly in the late stages of a systemic infection, when the fungal cells had spread to deep organs. Hence, SAP2 presumably supports the multiplication of the fungal cells within the infected organs, perhaps by providing nutrient supply, rather than the invasion into host tissues. The in vivo regulation of SAP2 was shown to be influenced by certain repeat structures in the promotor region of this gene. In the C. albicans model strain CAI4 that was used in this study even the two SAP2 alleles, which differed in this repeat region, were differentially regulated during the course of a systemic infection, the SAP2-2 allele being induced at an earlier infection stage than the SAP2-1 allele. In contrast to the other SAP genes, expression of SAP1 and SAP3 could be detected in only few infecting cells, and a role in pathogenicity could not be attributed to these genes in the infection models used in this work. During the course of an infection C. albicans presumably employs many different virulence factors at the same time in order to achieve the best possible adaptation to the corresponding host niche. Yet, a question that has hardly been addressed but may enhance our understanding of the host-microbe interactions is whether different properties of the fungal cell are regulated in a coordinated fashion by specific host signals. At least two signal transduction pathways, a MAP kinase cascade and a cAMP-dependent pathway ending in the transcriptional regulators CPH1 and EFG1, respectively, control hyphae formation in C. albicans. As dimorphic growth is important for infection and because expression of the genes SAP4-SAP6 is linked to the hyphal growth form in vitro, a possible dependence of hyphae-associated SAP gene expression on these regulators was analyzed by studying SAP5 expression in corresponding signal transduction mutants. SAP5 activation in vivo was reduced in cph1 as well as in efg1 single mutants. Therefore, both CPH1 and EFG1 contribute to SAP5 activation during infection. Since the cph1 mutant formed hyphae in infected tissue as efficiently as the wild-type strain, hyphae formation alone evidently was not sufficient for full SAP5 induction in vivo. On the other hand, induction of SAP5 in vivo did not depend on the hyphal growth form, because a reduced but still significant SAP5 expression was also detected in the efg1 mutant that grew only in the yeast form in the infected animals. In cells defective in both of the regulators an induction of SAP5 was hardly detectable. Therefore, these signalling pathways are important for the control of various cellular programs during infection and coordinate the expression of different virulence genes in C. albicans. The in vivo analysis of virulence gene expression of C. albicans provided insights into regulatory adaptation mechanisms of the pathogen in various host niches. The individual members of a virulence gene family of this fungus are differentially and stage-specifically regulated during infection and thus presumably contribute very specifically to pathogenesis. Moreover, various virulence traits can be regulated in a coordinated fashion during infection and in this way together support the adaptability of C. albicans to the host. Overall, these findings enhance our understanding of the pathogenicity of this important opportunistic fungal pathogen.…