Abstract

Der Großteil der in eukaryontischen Zellen ablaufenden chemischen Reaktionen finden in Zellkompartimenten statt, die durch Membranen eingeschlossen werden. SNARE-Proteine sind essentielle Komponenten für die Fusion von gleichartigen (homotypischen) als auch verschiedenartigen (heterotypischen) Membranen. SNAREs sind meist über eine C-terminale Transmembran-Domäne in der „Geber“-Membran verankert. N-terminale 60-70 Aminosäuren lange Hepta-Peptide (SNARE-Motiv) können über Coiled-Coil Formierung den Kontakt mit einem SNARE an der „Empfänger“-Membran herstellen (trans-SNARE Komplex). In der vorliegenden Arbeit wurden die Plasmamembran SNAREs SNC1 und SNC2 in Saccharomyces cerevisiae auf posttranslationale Modifikation durch Ubiquitin untersucht. Dabei stellte sich heraus, dass die Ubiquitylierung an mindestens zwei Lysinen im Substrat erfolgt. Die kovalente Verknüpfung erfolgt durch die Ubiquitin-Ligase RSP5. In Mutanten, die die Sekretion von SNC1/SNC2 zur Plasmamembran inhibieren (sec17-1, sec18-1, sed5-1 und sec1-1), liegen die SNAREs in nicht-modifizierter Form vor. In den Endozytose-Mutanten end3 und end4, die für die Invagination von endozytotischen Vesikeln defekt sind, akkumuliert ubiquityliertes SNC1 an der Plasmamembran. Die Ubiquitylierungs-Reaktion muß daher an der Plasmamembran erfolgen. Eine der Ubiquitylierungsstellen, Lysin-63, befindet sich in der Coiled-Coil-Domäne der SNAREs. Der Austausch des Lysins durch ein Arginin an dieser Stelle führt dazu, dass SNC1 nicht mehr in das Lumen der Vakuole lokalisiert wird. Stattdessen verbleibt das Protein in der Membran der Vakuole. Die zweite Ubiquitylierungsstelle konnte noch nicht identifiziert werden. Das Ubiquitin Bindeprotein DDI1 interagiert mit SNC1/SNC2, und beeinflußt die Verfügbarkeit des SNAREs für den trans-SNARE Komplex. Ob DDI1 über die interne UBA (ubiquitin-associated)-Domäne mit ubiquityliertem SNC1/SNC2 interagiert, ist noch unbekannt.