Abstract

Die Entstehung struktureller Chromosomenaberrationen in somatischen Zellen ist von besonderem biologischem Interesse, da Aberrationen mit Tumorgenese in Verbindung gebracht werden. Wie wir heute wissen, sind strukturelle Chromosomenaberrationen die Folge fehlerhafter Doppelstrangbruch (DSB)-Reparatur, wobei im einfachsten Fall die Enden von zwei (oder mehr) Bruchstellen durch so genannte nichthomologe Endverknüpfung in falscher Kombination verknüpft werden. Bis heute ist jedoch unklar, inwieweit die Kernarchitektur - das heißt die Positionierung der Chromosomen im Zellkern - die Wahrscheinlichkeit einer Aberrationsentstehung beeinflusst. Um Hinweise über den Einfluss der Kernarchitektur auf die Entstehung von Austausch-aberrationen zu gewinnen, bietet es sich an, Untersuchungen in einem Modellorganismus mit vergleichbar geringer Komplexität durchzuführen. Die Hefe Saccharomyces cerevisiae ist dazu sehr geeignet, da die Kernarchitektur in diesem Organismus recht gut charakterisiert ist. Die Interphasechromosomen der Hefe nehmen eine Rabl-ähnliche Konfiguration ein, bei der alle Zentromere in der Nähe der Zellkernperipherie in einer Rosettenstruktur als cluster angeordnet sind, und die in mehreren clustern vorliegenden Telomere präferentiell am gegenüberliegenden Pol an der Kernmembran verankert sind. Die Wahrscheinlichkeit interchromosomaler Interaktionen sollte daher im Bereich der Zentromere und Telomere am höchsten sein. In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss der Zellkernarchitektur auf die Aberrations-entstehung in zwei unterschiedlichen experimentellen Ansätzen in Hefe untersucht. Im ersten Ansatz wurde eine Kartierung von Translokations-Bruchpunkten durchgeführt, um anhand des Verteilungsmusters Aussagen über die Wahrscheinlichkeit der Entstehung von Austausch-aberrationen machen zu können. Dazu stand aus Vorarbeiten eine Kollektion von 16 Klonen Rekombinations-defizienter Hefestämme (rad52- bzw. rad54-Mutanten) zur Verfügung, die strahleninduzierte strukturelle Chromosomenaberrationen tragen (mit insgesamt 35 beteiligten Chromosomen). Die Chromosomen V und VIII waren bei diesen Klonen an der Ausbildung strahleninduzierter Aberrationen häufiger beteiligt, als aufgrund ihrer Länge zu erwarten war, ohne dass hierfür ein Grund ausgemacht werden konnte. Die Bruchpunkte auf den Chromosomen V und VIII, sowie ihren jeweiligen Translokationspartnern, wurden mit Hilfe zwei verschiedener Methoden kartiert, die jeweils auf den Nachweis der An- und Abwesenheit spezifischer Sequenzbereiche (Sonden) auf den aberranten chromosomalen Banden abzielten. Dabei zeigte sich, dass von den insgesamt 17 kartierten Bruchpunkten sieben Zentromer-nah (bis zu 100 kb vom Zentromer entfernt), drei Telomer-nah (bis zu 12 kb vom Telomer entfernt) und sieben in der interstitiellen Region liegen. Bruchpunkte in der interstitiellen Region zeigten sich also signifikant unterrepräsentiert, so dass hier auf einen Einfluss der Zellkernarchitektur auf die Aberrationsentstehung zu schließen ist. Im zweiten experimentellen Ansatz wurde ein Modellsystem in Hefe entwickelt, mit dem sich der Einfluss der initialen Position von DSB auf die Entstehungswahrscheinlichkeit inter-chromosomaler Fehlverknüpfung systematisch untersuchen lässt. Dazu wurde eine Serie von Hefestämmen hergestellt, in denen gleichzeitig jeweils zwei DSB enzymatisch mittels HO-Endonuklease induziert werden können. Die entsprechenden Enzymschnittstellen (HOcs) wurden dabei an verschiedenen chromosomalen Positionen eingesetzt, die aufgrund ihrer Entfernung zu Zentromer und/oder Telomer im Falle eines Kernarchitektureinflusses unterschiedliche Interaktionswahrscheinlichkeiten haben sollten. Nach DSB-Induktion sowie Reparatur wurde mittels PCR-Analyse untersucht, wie häufig es in den einzelnen Stämme im Zuge der Reparatur zu einer Fehlverknüpfung der Enden gekommen war. Dabei konnte gezeigt werden, dass die intra- und intermolekulare Verknüpfung bei der Reparatur in allen getesteten Bruchort-Konstellationen etwa gleich häufig war, d.h. es wurde kein Einfluss der Kernarchitektur auf die Aberrationsentstehung festgestellt. Dieses Ergebnis passt gut zu Befunden einer neueren Arbeit, in der gezeigt werden konnte, dass sich nach Induktion multipler DSB nur wenige RAD52-Foci im Zellkern bilden, die als Reparaturzentren/ „-fabriken“ erklärt werden. Entsprechend diesem Modell können damit auch initial weiter voneinander entfernte DSB zu Austauschaberrationen führen, da die jeweiligen Enden in den wenigen „Fabriken“ zusammentreffen können. Als Ursache für die in beiden Systemen erzielten unterschiedlichen Ergebnisse könnten also entweder die unterschiedlichen genetischen Hintergründe (Rekombinations-defizient im Vergleich zu Rekombinations-profizient) oder die unterschiedliche Struktur der Bruchenden (strahlen-induziert im Vergleich zu Endonuklease-induziert) in Betracht kommen.