Mechanistic dissection of myosin Va-based melanosome transport in vitro

Mechanistic dissection of myosin Va-based melanosome transport in vitro

Essenzielle zelluläre Prozesse wie Zellwachstum, Teilung und Transport von Cargo sind auf intrazellulären Transport angewiesen. Die dafür verantwortliche Transportmaschinerie besteht aus molekularen Motoren, die sich direktional auf Aktinfilamenten und Mikrotubuli, die als ‚zelluläre Straßen‘ fungieren, bewegen. Myosin Motoren laufen auf Aktinfilamenten, während Mikrotubuli den entgegengesetzt gerichteten Kinesin und Dynein Motoren als Straßen dienen. Interessanterweise sind in vielen Fällen die koordinierten (oder konkurrierenden) Aktivitäten der entsprechenden Aktin- und Mikrotubuli-basierten Transportsysteme für Cargotransport in vivo erforderlich. Trotz dem detaillierten Wissen über jedes einzelne Transportsystem sind nur sehr spärliche Informationen über die funktionelle Verbindung zwischen dem Aktin/Myosin- und dem Mikrotubuli/Kinesin/Dynein-System erhältlich. Um diese Lücke zu schließen konzentriert sich diese Arbeit auf die Frage: Wie kommunizieren die Aktin- und Mikrotubuli-basierten Transportsysteme um die richtige Zustellung von Cargo zu gewährleisten? Um Einblicke in die Mechanismen zu erhalten, die die Aktin- und Mikrotubuli-basierten Transportsysteme verbinden, habe ich Pigmentzellen (Melanophoren) von der Amphibie Xenopus laevis und Melanozyten von der Maus als zwei gut etablierte Modellsysteme verwendet. In Melanophoren werden Pigmentgranulen (Melanosomen) durch die vereinten Kräfte der Mikrotubuli-basierten Dynein-1 und Kinesin-2 Motoren und dem Aktin-basierten Myosin Va Motor transportiert. Dieser Transport findet durch extrazelluläre Signale statt, die die Direktionalität des Melanosomentransports in vivo definieren. Es ist lange bekannt, das die Proteinkinase A (PKA) den nach innen gerichteten (Aggregation, niedrige PKA-Aktivität) und nach außen gerichteten (Dispersion, erhöhte PKA-Aktivität) Melanosomentransport dirigiert. Trotzdem blieben die molekularen Mechanismen, die eine solche direktionale Verteilung regulieren, die letzten zwei Jahrzehnte unbekannt. Vorangegangene Arbeit enthüllte zahlreiche Details der Mikrotubuli-basierten Transportmaschinerie, wohingegen nur wenig über das Aktin-basierte Transportsystem bekannt ist, das essenziell für den Dispersionsprozess ist. Um mechanistische Einblicke in die Aktin-basierte Transportmaschinerie des Melanosomentransportes zu geben, habe ich die Aktin-basierte Motilität von aufgereinigten Melanosomen in vitro rekonstituiert. Außerdem habe ich die Komponenten der Aktin-basierten Transportmaschinerie (der dreiteilige Myosin Va Transportkomplex, der aus Rab27a, Melanophilin und Myosin Va besteht) von Xenopus laevis und Maus rekombinant exprimiert um eine umfangreiche in vitro Charakterisierung durchzuführen. Die Rekonstitution des Aktin-basierten Melanosomentransportes in vitro zeigte, dass Melanosomen von Zellen mit hoher PKA-Aktivität (dispergierter Zellstatus) einen signifikant erhöhten Myosin Va-abhängigen Transport aufweisen verglichen mit Melanosomen von Zellen mit niedriger PKA-Aktivität (aggregierter Zellstatus). Die Charakterisierung der Transportparameter des rekonstituierten Melanosomentransportes in vitro zeigte, dass PKA-Aktivität keinen Einfluss auf Geschwindigkeit oder Lauflänge der Melanosomen hatte. Ich habe die PKA als molekularen Schalter identifiziert, der direkt den Transport zwischen den entsprechenden Zellstatus auf der Melanosomenoberfläche reguliert. In vitro Phosphorylierungsexperimente mit den rekombinant exprimierten Komponenten Rab27a, Melanophilin und Myosin Va, die den dreiteiligen Myosin Va Transportkomplex in vivo bilden, demonstrieren, dass das Adaptorprotein Melanophilin das spezifische Phosphorylierungsziel der PKA in Xenopus und Maus ist. Besonders Melanophilin’s C-terminale Aktinbindedomäne ist ausgeprägtes Ziel der Phosphorylierung. Es ist beachtenswert, dass die in vitro Phosphorylierung von Melanophilin’s Aktinbindedomäne dem bereits beschriebenen in vivo Phosphorylierungsmuster sehr ähnlich ist. In meiner Arbeit stelle ich eine effiziente Strategie zur Assemblierung des dreiteiligen Myosin Va Transportkomplex in vitro vor, die es mir ermöglichte die funktionalen Konsequenzen der Melanophilin-Phosphorylierung in vitro zu testen. Dekorationsexperimente mit Aktin und dem Rab27a/Melanophilin-Komplex und Einzelmolekül-TIRF (interne Totalreflexionsfluoreszenz)-Mikroskopie-Experimente mit dem dreiteiligen Rab27a/Melanophilin/Myosin Va-Komplex auf Aktinfilamenten deckten unerwartet auf, dass die Phosphorylierung von Melanophilin’s Aktinbindedomäne nicht in Aktin-abhängige Prozesse, wie Melanophilin’s Bindung zu Aktin oder der Bewegung des Myosin Va-Transportkomplex auf Aktinfilamenten, eingreift. Stattdessen regulierte Melanophilin’s Phosphorylierungsstatus überraschend Melanophilin‘s Assoziation mit Mikrotubuli. Dephosphoryliertes Melanophilin zog die Bindung zu Mikrotubuli sogar in Gegenwart von Aktinfilamenten vor, währenddessen phosphoryliertes Melanophilin hauptsächlich mit Aktinfilamenten assoziierte auch wenn Mikrotubuli gegenwärtig waren. Tatsächlich gibt Melanophilin’s Phosphorylierungsstatus vor, welches Filament der Rab27a/Melanophilin/Myosin Va-Komplex wählt, wenn Mikrotubuli und Aktinfilamente gleichzeitig vorhanden sind. Genauer gesagt zeigte der dreiteilige Myosin Va-Transportkomplex mit phosphorylierten Melanophilin hauptsächlich direktionale Bewegung auf Aktinfilamenten in vitro, wie es von einem Aktin-basierten Motorprotein erwartet wird. Im Gegensatz dazu verstärkte die Dephosphorylierung von Melanophilin die Interaktion des dreiteiligen Myosin Va-Transportkomplexes mit Mikrotubuli und eine signifikante Anzahl an Komplexen zeigte Diffusion auf Mikrotubuli. Diese Ergebnisse decken die überraschende regulatorische Dominanz des Adaptorproteins Melanophilin über sein assoziertes Motorprotein Myosin Va auf und bieten einen Mechanismus an, wie Kommunikation zwischen dem Aktin- und Mikrotubuli-Transportsystemen in vivo bewerkstelligt werden könnte, und zwar durch das Adaptorprotein Melanophilin, das imstande ist mit Aktinfilamenten als auch mit Mikrotubuli zu interagieren. Die Bindungspreferenz des gesamten dreiteiligen Myosin Va- Transportkomplexes zu Aktinfilamenten oder Mikrotubuli wird durch den Phosphorylierungsstatus von Melanophilin reguliert. Zusammengenommen bieten die Beobachtungen dieser Arbeit erste Einblicke in das funktionelle Zusammenspiel zwischen den zwei zytoskelettalen Transportsystemen und stellen eine mechanistische Erklärung bereit, wie Zellen den Transport auf dem einen oder anderen zytoskelletalen Filament verschieben könnten., Essential cellular processes such as cell growth, division, migration, and cargo delivery rely on intracellular transport. The transport machinery responsible for such processes consists of molecular motors that move directionally on actin filaments or microtubules, which serve as ‘cellular roads’. Myosin motors walk on actin filaments, whereas microtubules serve as tracks for the oppositely directed kinesin and dynein motors. Interestingly, in many cases, the coordinated (or competing) activities of the respective actin- and microtubule-based systems are required for cargo transport in vivo. Despite the detailed knowledge on each individual transport system, only very sparse information is available on the functional interface between the actin/myosin- and the microtubule/kinesin/dynein-systems. To close this gap, this thesis is focused on the question: how is crosstalk between the actin- and microtubule-based transport systems achieved to bring about correct cargo delivery? To gain insights into the mechanisms that link the actin- and microtubule-based transport systems, I used pigment cells (melanophores) from the amphibian Xenopus laevis and melanocytes from mouse as two well-established model systems. In melanophores, pigment granules (melanosomes) are transported by the concerted action of the microtubule-based dynein-1 and kinesin-2 motors and the actin-based myosin Va motor upon external cues that in turn define the overall directionality of transport in vivo. It is long known that protein kinase A (PKA) orchestrates the inward (aggregation, decreased PKA activity) and the outward (dispersion, increased PKA activity) of movement of melanosomes. However, molecular mechanism(s) of how such directional distribution is regulated remained elusive over the past two decades. Previous work illuminated numerous details of the microtubule-based transport machinery that move the melanosome, whereas only little is known about the actin-based transport system that is essential for the dispersion process. To provide mechanistic insights into the actin-based machinery of melanosome transport, I reconstituted the actin-based motility of purified melanosomes in vitro. Furthermore, I recombinantly expressed the components of the actin-based transport machinery (the tripartite myosin Va transport complex consisting of Rab27a, melanophilin, and myosin Va) from Xenopus laevis and mouse to perform an extensive in vitro characterization. Reconstituting the actin-based transport of melanosomes in vitro revealed that melanosomes from cells with high PKA activity (i.e. dispersed cell state) exhibit significantly increased myosin Va-dependent transport compared to melanosomes derived from cells with low PKA activity (i.e. aggregated cell state). Characterizing the transport parameters of the reconstituted melanosome transport in vitro showed that PKA activity did not influence velocity or run length of melanosomes. I identified PKA as the molecular switch that directly regulates this transport between the respective cell states on the melanosome surface. In vitro phosphorylation assays with the recombinantly expressed components Rab27a, melanophilin, and myosin Va that form the myosin Va tripartite transport complex in vivo demonstrate that the adaptor protein melanophilin is the specific phosphorylation target of PKA in Xenopus and mouse. Particularly melanophilin’s C-terminal actin-binding domain is a pronounced phosphorylation target. Of note, in vitro phosphorylation of melanophilin’s actin-binding domain closely resembled the previously described in vivo phosphorylation pattern. In my work, I present an efficient strategy to assemble the tripartite myosin Va transport complex in vitro that enabled me to test the functional consequences of melanophilin phosphorylation in vitro. Filament decoration assays with actin and the Rab27a/melanophilin complex and single-molecule total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy assays with the tripartite Rab27a/melanophilin/myosin Va complex on actin filaments revealed unexpectedly that phosphorylation of melanophilin’s actin-binding domain did not interfere with actin-dependent processes such as binding of melanophilin to actin filaments or movement of the tripartite complex along actin filaments. Surprisingly instead, melanophilin’s phosphorylation state regulated its association with microtubules in vitro. Dephosphorylated melanophilin preferred to bind to microtubules even in the presence of actin filaments, whereas phosphorylated melanophilin predominantly associated with actin filaments when microtubules were also present. In fact, melanophilin’s phosphorylation state enforced track selection of the tripartite Rab27a/melanophilin/myosin Va complex when microtubules and actin filaments were present simultaneously. More precisely, the tripartite complex assembled with phosphorylated melanophilin mostly exhibited directional movement on actin filaments in vitro, as expected of an actin-based motor protein. In contrast, dephosphorylation of melanophilin enhanced the interaction between the tripartite complex and microtubules and a signification number of complexes showed diffusional movement on microtubules. These results reveal the surprising regulatory dominance of the adaptor protein melanophilin over its associated motor protein myosin Va and provide a mechanism of how crosstalk between the actin- and microtubule-transport systems might be achieved in vivo; namely through the adaptor protein melanophilin that is capable of interacting with both actin filaments and microtubules. The binding preference of the entire tripartite complex for actin or microtubules is regulated via the phosphorylation state of melanophilin. Taken together, the observations presented in this thesis offer first insights into the functional interface between the two cytoskeletal transport systems and provide a mechanistic explanation how cells might bias cargo transport on one or the other cytoskeletal filament.

melanosome, myosin Va, melanophilin, intracellular transport, actin, microtubules, PKA

26. Oct. 2017

2017

Englisch

https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:bvb:19-213575