The regulation of the ADP-ribosyl-hydrolase MacroD2 upon DNA damage

The regulation of the ADP-ribosyl-hydrolase MacroD2 upon DNA damage

To cope with the rapid changes in the environment, all the cellular processes must be carefully regulated and this is often achieved by means of the posttranslational modifications. These chemical modifications added to the side chains of amino acids in protein sequences have a variety of consequences, ranging from the stability to the change in protein-protein interactions. One of these post-translational modifications is ADP-ribosylation. ADPribosylation is mainly associated to the regulation of DNA damage repair, although it is important for the modulation of a large variety of cellular processes. Being a complex signaling pathway, ADP-ribosylation requires a likely complex metabolism and a number of transferases and hydrolases orchestrate its spatial and temporal dynamics. Among the latter, MacroD2 removes the most proximal ADP-ribosyl-moiety from the glutamate of a substrate protein. My host lab is interested in the understanding of the modulation of the DNA damage repair response by focusing on the ADP-ribosyl-hydrolases. This brought my direct supervisor, Dr. G. Timinszky, to discover a particular phenomenon associated to MacroD2 protein: when the protein is tagged with EGFP, upon DNA damage it recruits to the DNA lesion, while its nuclear signal decreases over time. The work of my PhD aimed to understand and characterize the strange DNA damage-dependent behavior of MacroD2. For my work, I use a combination of microscopy and biochemical technics. Thus, I show that the decrease in MacroD2 nuclear protein levels is due to its regulated nuclear export. This behavior of EGFP-tagged MacroD2 construct is also performed by the endogenous protein. I then characterize the stimulus that triggers MacroD2 nuclear export. Upon DNA damage, mostly upon formation of double-strand breaks, the kinase ATM, master regulator of genotoxic stress response, is activated. ATM induces the phosphorylation of MacroD2 on two specific serine residues located in the MacroD2 intrinsically disordered C-terminus region. This event triggers the nuclear export of MacroD2. I also show that MacroD2 nuclear export is able to affect its own recruitment dynamics at the DNA lesion, suggesting a potential role in the regulation of the DNA damage response. Although I defined the events inducing MacroD2 nuclear export, to understand the mechanism with which MacroD2 crosses the nuclear envelope, I performed a co-immunopurification experiment associated to peptide mass fingerprinting. By comparing genotoxic stress condition to the control, and a series of MacroD2 constructs (full-length protein, macrodomain or Cterminus fragments), it is possible to draw the interactome of the protein for the specific constructs in the specific conditions. The experiment does not indicate any candidate that could drive MacroD2 into the cytoplasm. On the other hand, the co-immunopurification experiment suggests few hypotheses about MacroD2 functional roles in the cells. In fact, although little is known about MacroD2 functions, by combining the analyses on the enriched proteins with published studies, I formulate testable hypotheses able to connect the enzymatic activity of MacroD2 to its genomic association with autism syndrome., Alle zellulären Prozesse müssen genau reguliert werden, um auf plötzliche Umwelteinflüsse reagieren zu können. Dies wird häufig durch posttranslationale Modifikationen erreicht. Hierbei werden chemische Modifikationen an Aminosäureseitenketten hinzugefügt. Dies kann viele, verschiedene Auswirkungen auf Zellen haben, von Änderungen der Proteinstabilität bis zu unterschiedlichen Proteininteraktionen. Eine dieser Modifikationen ist die ADP-ribosylierung von Proteinen. ADP-ribosylierung wird hauptsächlich mit der Reparatur von DNA-Schäden verbunden, obwohl diese Modifikation für eine Vielfalt von weiteren zellulären Prozessen von Bedeutung ist. Da ADP-ribosylierung ein komplexer Signaltransduktionsweg ist, wird ein extensiver Metabolismus benötigt, welcher aus mehreren Transferasen und Hydrolasen besteht. Diese Enzyme bestimmen die örtliche und zeitliche Dynamik dieses Prozesses. Eines der Enzyme ist MacroD2, das den ADPribose-Rest, welcher über einen Glutamatrest proximal an ein Substratprotein gebunden ist, entfernt. Der Arbeitskreis von Dr. G. Timinszky am department für physiologische Chemie der LMU ist daran interessiert herauszufinden, wie die Reparatur von DNA-Schäden modifiziert wird, insbesondere durch ADP-Ribosyl- Hydrolasen. Dies führte zur Entdeckung eines besonderen Phänomens von MacroD2 durch meinen direkten Betreuer Dr. G. Timinszky. EGFP-markiertes MacroD2 rekrutiert zu induzierten DNA-Läsionen, wobei das nukleäre EGFP Signal über die Zeit geringer wird. Das Ziel meiner Doktorarbeit war es, dieses bemerkenswerte Verhalten von MacroD2 nach der Induktion von DNA-Schäden zu verstehen und zu charakterisieren. In meiner Doktorarbeit habe ich eine Kombination von Mikroskopie und biochemischen Methoden verwendet. Damit konnte ich zeigen, dass die Reduktion des nukleären MacroD2s durch dessen regulierten Zellkernexport hervorgerufen wird. Dieses Verhalten von EGFP-markiertem MacroD2 wurde auch bei endogenem MacroD2 nachgewiesen. Ich konnte auch den Stimulus charakterisieren, der dazu führt, dass MacroD2 aus dem Zellkern exportiert wird. Durch DNA-Schäden, hauptsächlich durch DNA-Doppelstrangbrüche, wird die Kinase ATM aktiviert, welche Signalkaskaden in der Zelle startet, um auf genotoxischen Stress zu antworten. ATM phoshoryliert MacroD2 an zwei spezifischen Serinresten in dessen ungeordneter, C-terminaler Region. Dies hat den Export von MacroD2 aus dem Zellkern zur Folge. Ich konnte des Weiteren zeigen, dass der Zellkernexport von MacroD2 dessen Rekrutierungsdynamik an DNA-Läsionen beeinflusst. Dies spricht für eine potentielle Rolle von MacroD2 in der Antwort auf DNA-Schäden. Nachdem ich den Mechanismus definieren konnte, der dazu führt, dass MacroD2 aus dem Zellkern exportiert wird, war es wichtig herauszufinden, durch welchen Mechanismus MacroD2 die Kernmembran passieren kann. Hierfür habe ich Co-Immunopräzipitationen mit anschließender Analyse der Peptid-massen-fingerprints durchgeführt. Durch den Vergleich von genotoxischen Stressbedingungen mit Kontrollbedingungen und durch die Verwendung mehrerer MacroD2 Konstrukte (Volllängenprotein, Macrodomäne und C-terminale Domäne) ist es möglich das Interaktom der Proteine mit MacroD2 für verschiedene Konstrukte und Bedingungen zu definieren. Diese Experimente zeigten jedoch keinen Kandidaten, welcher MacroD2 aus dem Zellkern in das Zytoplasma exportieren könnte. Andererseits konnten mehrere Hypothesen über funktionelle Aufgaben von MacroD2 in Zellen aufgestellt werden. Obwohl wenig über Funktionen von MacroD2 bekannt ist, konnte ich, durch die Kombination der Analyse von angereicherten Proteinen und publizierten Ergebnissen, prüfbare Hypothesen aufstellen. Diese Hypothesen verbinden die enzymatische Funktion von MacroD2 mit genomweiten Assoziationsstudien über das Autismus Syndrom.

MacroD2, ADP-ribosyl-hydrolase, ATM, nuclear export

04. May 2017

2017

Englisch

https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:bvb:19-207951