Mechanism of actin polymerization with yeast formin Bni1p. effect of the KCI concentration on the FH2 mediated actin nucleation

Mechanism of actin polymerization with yeast formin Bni1p. effect of the KCI concentration on the FH2 mediated actin nucleation

Formin proteins are actin nucleators and elongators which can be found in most eukaryotic cells. In this work, structure-function relationships between yeast formin Bni1p and actin polymerization were studied. In the first part of this work, it was attempted to clone and express formin constructs derived from yeast Bni1p (Saccharomyces cerevisiae), including the key FH2 domain and a modified FH1 domain. Biomathematical models involving both diffusion and concentration-limited actin recruitment kinetics could be tested with such proteins. Cloning was mostly successful, but only the FH2 domain alone was expressed. In the second part of this work, a salt effect on FH2 mediated actin nucleation was discovered by means of pyrene assays and epifluorescence microscopy. Potassium chloride (KCl) is a downregulator of FH2 nucleation activity: a higher KCl concentration leads to a significantly lower actin polymerization speed (kp, m), to a bigger lag time (tlag) and to a bigger t1/2, with the respective actin filament length distributions. The salt effect was shown to be significant in a KCl concentration range from 10 mM to 90 mM at two different FH2 concentration, but not in absence of FH2. The critical KCl concentration is lowered in the presence of FH2. Some initial experiments with sodium chloride point to a non-specific nature of this salt. This is in agreement with the electrostatic nature of the salt effect, which was studied further by computational means: A decrease of the KCl concentration leads to lower binding free energies of the protein-protein interactions in the crystallographically characterized actin-FH2 complex 1Y64. This is especially the case for the electrostatic Coulomb interaction of a specific area ("lasso" site). ANCHOR calculation results of solvent accessible surface areas (SASAs) corroborate the importance of this site. The experimentally found downregulation of FH2 mediated actin nucleation by KCl can therefore be explained by reduced actin recruitment by the FH2 dimer: KCl diminishes the surface charge of FH2 and actin and thus weakens electrostatic Coulomb interactions. In future, this newly discovered salt effect should be considered in experiments on formins, for example when performing in vitro screens for FH2 inhibitors. The relevance of this new salt effect in vivo remains to be demonstrated., Forminproteine sind Aktinnukleatoren und -elongatoren, die in fast allen eukaryotischen Zellen vorkommen. Es wurden in dieser Arbeit Struktur-Funktionsbeziehungen zwischen dem Hefeformin Bni1p und der Aktinpolymerisation untersucht. Im ersten Teil der Arbeit wurde versucht, verschiedene Forminkonstrukte des Hefeformins bni1p (Saccharomyces cerevisiae) mit der Schlüsseldomäne FH2 und gegebenenfalls modifizierter FH1-Domänen zu exprimieren, um damit biomathematische Modelle testen zu können, die sowohl eine diffusions- als auch eine konzentrationslimitierte Kinetik der Aktinrekrutierung annehmen. Die meisten Klonierungen gelangen, exprimiert werden konnte jedoch nur die FH2-Domäne allein. Pyrene-Assays und epifluoreszenzmikroskopische Aufnahmen konnten im zweiten Teil der Arbeit einen bisher nicht bekannten Salzeffekt auf die FH2-vermittelte Aktinnukleation nachweisen. Der Salzeffekt wurde für Kaliumchlorid (KCl) im Konzentrationsbereich 10 mM < c(KCl) < 90 mM untersucht und war signifikant für zwei Versuchsserien mit unterschiedlichen FH2-Konzentrationen, jedoch nicht in Abwesenheit von FH2. KCl reguliert im genannten Konzentrationsbereich die Aktinnukleationsaktivität von FH2 herunter: Eine höhere KCl-Konzentration führt zu einer signifikant niedrigeren Polymerisationsgeschwindigkeit (kp, m), zu einer größeren lag time (tlag) und zu einer größeren t1/2, mit einer dazu passenden Längenverteilung der Aktinfilamente. Die kritische KCl-Konzentration sinkt in Anwesenheit von KCl. Erste Experimente mit Natriumchlorid deuten an, dass der Effekt unspezifisch ist. Das passt zu der elektrostatischen Natur dieses Salzeffektes, die auch bioinformatisch untersucht wurde: Für eine niedrigere KCl-Konzentration wurden niedrigere freie Bindungsenergien für die Protein-Protein-Interaktion eines kristallographisch beschriebenen Aktin-FH2-Komplexes (1Y64) berechnet. Das gilt insbesondere für die elektrostatischen Coulomb-Wechselwirkungen eines bestimmten Bereiches (Lasso). ANCHOR-Berechnungen der der exponierten Proteinoberflächen (SASAs) weisen ebenfalls auf die Bedeutung dieses Bereiches hin. Die Herunterregulierung der FH2-vermittelten Aktinnukleation durch Kaliumchlorid kann daher mit einer reduzierten Aktinrekrutierung durch das FH2-Dimer erklärt werden: KCl vermindert die Oberflächenladung von FH2 und Aktin und schwächt so elektrostatische Coulomb-Wechselwirkungen. In der Zukunft sollte dieser neu gefundene Salzeffekt bei in vitro - Experimenten mit Forminen berücksichtigt werden, zum Beispiel beim Screening nach FH2-Inhibitoren. Es ist künftig ferner von Interesse, welche Folgen dieser neu gefundene Salzeffekt auf die FH2-vermittelte Aktinnukleation in vivo hat.

actin polymerization, formin, FH2, salt effect, nucleation

04. Oct. 2012

2012

Englisch

https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:bvb:19-149371