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Charakterisierung der biologischen Aktivität von Hühner Interleukin-6 und erste Untersuchungen zum Toll-like Rezeptor-System des Huhnes
Charakterisierung der biologischen Aktivität von Hühner Interleukin-6 und erste Untersuchungen zum Toll-like Rezeptor-System des Huhnes
Ein Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die biologische Aktivität des kürzlich von Schneider et al. klonierten, rekombinanten Hühner IL-6 (rChIL-6), zu charakterisieren. In vitro wurde der Nachweis der biologischen Aktivität von rChIL-6 durch die Induktion der Proliferation der streng IL-6 abhängigen murinen Zelllinie 7TD1 erbracht. Diese Tatsache wurde für die Etablierung eines quantitativen rChIL-6 Nachweissystems genutzt. Für weiterführende Studien wurde ein neutralisierendes, polyklonales ChIL-6 Antiserum entwickelt. Durch wiederholte Vakzinierung von Kaninchen mit rChIL-6 (E.coli) war es möglich, ein ChIL-6 Antiserum zu gewinnen, welches auch die biologische Aktivität von natürlichem ChIL-6 neutralisiert. In vivo induzierte die intravenöse Applikation von rChIL-6 (E.coli) einen deutlichen Anstieg der Kortikosteronkonzentration im Serum von Hühnern. Somit standen mit biologisch aktivem rChIL-6, einem ChIL-6 Nachweistest und einem neutralisierenden Antiserum geeignete Werkzeuge zur Verfügung, die für erste Untersuchungen zur funktionellen Charakterisierung des aviären Toll-like Rezeptor (TLR)-Systems genutzt wurden. Diese, unter anderem auf Makrophagen exprimierten Rezeptoren, sind für eine adäquate Reaktion des Immunsystems von essentieller Bedeutung, denn sie erkennen die Anwesenheit pathogener Mikroorgansimen anhand so genannter „pathogen-associated molecular pattern“ (PAMP). Eine Konsequenz der Rezeptoraktivierung ist die Transkription von Genen pro-inflammatorischer Cytokine, unter anderem von IL-6. Primäre Hühnermakrophagen wurden durch Inkubation mit verschiedenen, aus dem Säuger-System bekannten TLR-Agonisten stimuliert; als Nachweissystem der erfolgreichen Aktivierung wurde die quantitative Analyse der ChIL-6 Sekretion genutzt. Zunächst wurden primäre Hühnermakrophagen mit LPS stimuliert worauf sie mit einer starken ChIL-6 Sekretion reagierten. Durch die gleichzeitige Inkubation der Makrophagen mit LPS und IFN- ließ sich das Ausmaß der ChIL-6 Sekretion deutlich steigern. Auch die Inkubation mit bakterieller DNA induzierte die Sekretion von ChIL-6. Dieser Makrophagen-aktivierende Effekt war DNA-spezifisch, denn zum einen beendete der DNA Verdau mit DNase I diesen Effekt. Zum anderen induzierten CpG-ODNs nicht aber GpC-ODNs eine starke ChIL-6 Sekretion. Weiterhin führte die Stimulation der Makrophagen mit synthetischem bakteriellem Lipopeptid und synthetischer dsRNA zu einer deutlichen Sekretion von ChIL-6. Bei in vivo Studien wurde eine deutliche Induktion von ChIL-6 durch LPS (TLR 4) beobachtet. Im Rahmen dieser Arbeit konnte also gezeigt werden, dass rekombinantes ChIL-6 sowohl in vitro als auch in vivo biologisch aktiv ist. Auf der Basis der dabei etablierten Methoden konnte bei ersten Untersuchungen zur funktionellen Charakterisierung des TLR-Systems des Huhnes Hinweise dafür gewonnen werden, dass beim Huhn funktionelle Homologe zu den, aus dem Säuger bekannten TLR 2, 3, 4, und 9 vorhanden sind
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Klaas, Reinhard
2003
Deutsch
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Klaas, Reinhard (2003): Charakterisierung der biologischen Aktivität von Hühner Interleukin-6 und erste Untersuchungen zum Toll-like Rezeptor-System des Huhnes. Dissertation, LMU München: Tierärztliche Fakultät
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Abstract

Ein Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die biologische Aktivität des kürzlich von Schneider et al. klonierten, rekombinanten Hühner IL-6 (rChIL-6), zu charakterisieren. In vitro wurde der Nachweis der biologischen Aktivität von rChIL-6 durch die Induktion der Proliferation der streng IL-6 abhängigen murinen Zelllinie 7TD1 erbracht. Diese Tatsache wurde für die Etablierung eines quantitativen rChIL-6 Nachweissystems genutzt. Für weiterführende Studien wurde ein neutralisierendes, polyklonales ChIL-6 Antiserum entwickelt. Durch wiederholte Vakzinierung von Kaninchen mit rChIL-6 (E.coli) war es möglich, ein ChIL-6 Antiserum zu gewinnen, welches auch die biologische Aktivität von natürlichem ChIL-6 neutralisiert. In vivo induzierte die intravenöse Applikation von rChIL-6 (E.coli) einen deutlichen Anstieg der Kortikosteronkonzentration im Serum von Hühnern. Somit standen mit biologisch aktivem rChIL-6, einem ChIL-6 Nachweistest und einem neutralisierenden Antiserum geeignete Werkzeuge zur Verfügung, die für erste Untersuchungen zur funktionellen Charakterisierung des aviären Toll-like Rezeptor (TLR)-Systems genutzt wurden. Diese, unter anderem auf Makrophagen exprimierten Rezeptoren, sind für eine adäquate Reaktion des Immunsystems von essentieller Bedeutung, denn sie erkennen die Anwesenheit pathogener Mikroorgansimen anhand so genannter „pathogen-associated molecular pattern“ (PAMP). Eine Konsequenz der Rezeptoraktivierung ist die Transkription von Genen pro-inflammatorischer Cytokine, unter anderem von IL-6. Primäre Hühnermakrophagen wurden durch Inkubation mit verschiedenen, aus dem Säuger-System bekannten TLR-Agonisten stimuliert; als Nachweissystem der erfolgreichen Aktivierung wurde die quantitative Analyse der ChIL-6 Sekretion genutzt. Zunächst wurden primäre Hühnermakrophagen mit LPS stimuliert worauf sie mit einer starken ChIL-6 Sekretion reagierten. Durch die gleichzeitige Inkubation der Makrophagen mit LPS und IFN- ließ sich das Ausmaß der ChIL-6 Sekretion deutlich steigern. Auch die Inkubation mit bakterieller DNA induzierte die Sekretion von ChIL-6. Dieser Makrophagen-aktivierende Effekt war DNA-spezifisch, denn zum einen beendete der DNA Verdau mit DNase I diesen Effekt. Zum anderen induzierten CpG-ODNs nicht aber GpC-ODNs eine starke ChIL-6 Sekretion. Weiterhin führte die Stimulation der Makrophagen mit synthetischem bakteriellem Lipopeptid und synthetischer dsRNA zu einer deutlichen Sekretion von ChIL-6. Bei in vivo Studien wurde eine deutliche Induktion von ChIL-6 durch LPS (TLR 4) beobachtet. Im Rahmen dieser Arbeit konnte also gezeigt werden, dass rekombinantes ChIL-6 sowohl in vitro als auch in vivo biologisch aktiv ist. Auf der Basis der dabei etablierten Methoden konnte bei ersten Untersuchungen zur funktionellen Charakterisierung des TLR-Systems des Huhnes Hinweise dafür gewonnen werden, dass beim Huhn funktionelle Homologe zu den, aus dem Säuger bekannten TLR 2, 3, 4, und 9 vorhanden sind