Diagnostische DNA-Microarrays zum Nachweis von Beta-Lactam-Resistenzen in der klinischen Mikrobiologie mittels Genotypisierung bakterieller Resistenzgene

Abstract

Eine der größten Resistenzproblematiken in der Humanmedizin ist die Unempfindlichkeit gramnegativer Infektionserreger, wie z. B. E. coli oder K. pneumoniae, gegenüber modernen Beta-Lactam-Antibiotika. Diese wird hauptsächlich durch die Produktion plasmidkodierter Beta Lactamasen mit erweitertem Wirkspektrum (ESBL) vermittelt. Als ESBLs wurden zunächst Varianten der TEM- und SHV-Enzyme bezeichnet, die aufgrund von Mutationen und den daraus folgenden Aminosäure-Substitutionen ein erweitertes Substratspektrum besitzen. Zusätzliche Varianten sind resistent gegenüber Beta Lactam-Inhibitoren (IRT) oder werden als komplexe Varianten (CMT) bezeichnet. Inzwischen besitzt die CTX-M-Enzymfamilie große klinische Relevanz und ist in Europa vorherrschend. Von wachsender Bedeutung sind ebenfalls plasmidkodierte AmpC-Beta Lactamasen und einige Beta-Lactamasen der Ambler Klasse D (OXA). Infektionserreger, die diese Enzyme produzieren, werden immer häufiger registriert und verursachen eine Vielzahl von Problemen bei der Therapie, Infektionskontrolle und Krankenhaushygiene. Die ESBL-Detektion ist zu einer klinischen Herausforderung geworden und klassische phänotypische Methoden werden den Anforderungen in diesem Bereich oft nicht gerecht. Ursächlich hierfür sind vor allem die heterogenen Substrataffinitäten der verschiedenen Enzyme. Die meist notwendigen Bestätigungstests verzögern das Testresultat und machen eine prospektive Therapie unmöglich. Da eine falsche empirische Therapie zu einem erhöhten Selektionsdruck, höheren Mortalitätsraten und Kosten führt, ist eine schnelle und eindeutige Information hinsichtlich der Resistenz eines Erregers essentiell. Molekulare Methoden haben ein großes Potential zur Beschleunigung der Erregerdiagnostik. Mit Hilfe der Microarray-Technologie können verschiedene Resistenzgene in weniger als einem Tag nachgewiesen und bis zur Identifikation der allelischen Variante genotypisiert werden. Anschließend können alle Informationen, die über das codierte Enzym zur Verfügung stehen, einschließlich des Substratspektrums, für die Therapieentscheidung und epidemiologische Fragestellungen genutzt werden. In dieser Arbeit wurde ein integrierter diagnostischer DNA-Microarray für den schnellen Nachweis und die Genotypisierung der in gramnegativen Bakterien häufigsten ESBL-assoziierten Resistenzgenfamilien, blaTEM, blaSHV und blaCTX-M, entwickelt und validiert. Der Microarray umfasst 618 spezifische Sonden, die in 2172 Spots angeordnet sind und zur Identifizierung von Mutationen dienen, die für 156 unterschiedliche Aminosäureaustausche verantwortlich sind. Daraus resultiert eine bisher unerreicht hohe Abdeckung bekannter TEM-, SHV- und CTX-M-Varianten. Nach umfangreichen Optimierungen in den Bereichen Sondendesign, Hybridisierungsbedingungen und der Etablierung einer effizienten Amplifikationsstrategie für die drei bla-Gene wurde der Chip mit 60 verblindeten klinischen Isolaten getestet, von denen 58 phänotypisch als ESBL-positiv charakterisiert wurden. Der Microarray-basierte Assay konnte die Genotypen der Isolate mit einer hervorragenden Diskriminierung und Reproduzierbarkeit auflösen, zeigte eine gute Genotyp-Phänotyp-Korrelation und eine robuste Identifikation von Mischungen von Varianten der gleichen Genfamilie. Die Daten der Studie wurden mittels Sequenzierung bestätigt. Die ESBL-Phänotypen konnten auf ESBL-Varianten von blaCTX-M (76 %), blaSHV (22 %) oder beiden (2 %) zurückgeführt werden. ESBL-Varianten von blaTEM wurden nicht nachgewiesen. Zwei Isolate, die aus unterschiedlichem Probenmaterial desselben Patienten stammten, enthielten jeweils zwei ESBL-Varianten von blaCTX-M (CTX-M-15 und CTX-M-14b). Die am häufigsten identifizierten ESBLs waren CTX M-15 (57 %) und SHV-12 (18 %). Aufgrund einer Dauer von 4,5 h und der hohen Abdeckung ESBL-assoziierter Gene und Genvarianten, könnte der hier entwickelte Assay eine interessante Option für den Resistenznachweis in der klinischen Mikrobiologie und die Überwachung der Verbreitung dieser Resistenzgene darstellen. Für die spätere Erweiterung des ESBL-Chips wurde ein Microarray für den Nachweis und die Identifikation von plasmidkodierten AmpC-Beta-Lactamasen entwickelt und erfolgreich mit Vertreten der C. freundii-Gruppe plasmidkodierter AmpCs getestet. Des Weiteren wurde die Validierung eines zuvor entwickelten OXA-Chips erfolgreich abgeschlossen. Diese Chips werden in Zukunft den klinischen Nutzen des Verfahrens noch einmal deutlich erhöhen.

One of the major threats in human healthcare is the resistance of widespread Gram-negative pathogens, such as E. coli, Klebsiella spp. or other Enterobacteriacae, against broadspectrum beta-lactam antibiotics. Predominantly, these resistances are conferred by the production of extended-spectrum beta-lactamases (ESBLs). Initially, TEM and SHV type beta-lactamases with an extended substrate spectrum determined by specific point mutations were designated as ESBLs. Other mutational events that affect substrate affinity for beta-lactamase inhibitors lead to inhibitor resistant (IRT) or complex mutant type (CMT) enzymes. During the last ten years, other ESBLs have gained increased importance, especially the CTX-M enzymes, which now have become most prevalent in Europe and other parts of the world. Additionally, plasmid-mediated AmpC beta-lactamases and several beta-lactamases of the Ambler class D (OXA) have emerged in the clinics. Pathogens producing such enzymes are detected more frequently and have become a concern in medical bacteriology as ESBL production has been associated with higher mortality, increased length of stay, delay of appropriate therapy and higher costs. Thus, fast and accurate identification of the antimicrobial resistance of the etiologic pathogen is decisive for the initiation of an appropriate antimicrobial therapy and hospital infection control measures. Despite considerable efforts at improvement, routine culture-based phenotypic ESBL detection is not always able to detect an ESBL and usually requires two days or more. This is mainly due to the highly variable activity against potential substrates of the different enzymes (or enzyme variants). Necessary confirmation tests delay the test results and prevent a prospective therapy. In addition, phenotype-based resistance tests also do not provide gene variant information which limits their usefulness for epidemiologic surveillance and refined antimicrobial therapy. Molecular ESBL detection has the potential to improve ESBL diagnosis. Using DNA Microarray technology as a genotyping platform, different genes conferring resistance and in particular those encoding for beta-lactamases can be detected and identified in less than one day. The identification of the allelic variant provides important information about the encoded enzyme, including the substrate spectrum, which can be used for therapy decisions, infection control and epidemiological surveillance. This work describes the development and validation of an integrated diagnostic oligonucleotide microarray for the rapid identification of ESBLs in Gram-negative bacteria by genotyping the three most prevalent beta-lactamase gene families, namely blaTEM, blaSHV and blaCTX-M. The array consists of 618 probes arranged in 2172 spots which cover mutations responsible for 156 amino acid substitutions. As this comprises unprecedented genotyping coverage, the ESBL array has a high potential for epidemiological studies and infection control. With an assay time of 4.5 hours the ESBL microarray could also be an attractive option for the development of rapid antimicrobial resistance tests in the future. After extensive optimization of hybridization conditions and the applied probe design the validity of the DNA microarray was demonstrated with 60 blinded clinical isolates which were collected during clinical routine. 58 of them were phenotypically characterized as ESBL. The chip demonstrated an excellent resolution, high phenotype-genotype correlation, and robustness towards mixed genotypes. The microarray data were confirmed by standard DNA sequencing. ESBL phenotypes could be correctly ascribed to ESBL variants of blaCTX-M (76 %), blaSHV (22 %) or both (2 %), whereas no ESBL variant of blaTEM was found. Two isolates originating from different specimen of the same patient each contained two ESBL blaCTX-M variants. The most prevalent ESBLs identified were CTX-M-15 (57 %) and SHV-12 (18 %). To further increase the ESBL-chip coverage for other lactamases, a DNA microarray for the detection and identification of plasmid-mediated AmpC beta-lactamases was developed and successfully tested with members of the Citrobacter freundii-group of plasmid-mediated AmpCs. Furthermore, the validation of a previously developed microarray for OXA-type beta lactamases was completed. The integration of those two chips will further enhance the clinical value of the ESBL-chip assay.