Characterization of novel proteins involved in catabolite degradation of fructose-1,6-bisphosphatase in saccharomyces cerevisiae

Abstract

Glycolysis and gluconeogenesis are reciprocally controlled central metabolic pathways in cells. Catabolite degradation of fructose-1,6-bisphosphatase (FBPase) is a key regulatory step, when Saccharomyces cerevisiae cells switch from anabolic gluconeogenesis to catabolic glycolysis. Addition of glucose to cells growing on a non-fermentable carbon source causes FBPase phosphorylation resulting in a decrease of enzymatic activity. This is followed by a proteolytic breakdown of the enzyme via the ubiquitin-proteasome system with a half-life of 20-30 min. In a genome wide screen nine so called gid mutants (glucose induced degradation deficient) defective in proteasome-dependent catabolite degradation of FBPase were identified. Analysis of Gid2 revealed that this protein is a part of a soluble, cytosolic protein complex with a molecular mass of at least 600kDa (Regelmann et al., 2003). The work of this thesis focuses on the analysis of the novel Gid proteins and their possible role in a higher molecular mass protein complex. To be able to detect Gid proteins immunologically, functional chromosomally HA eptitope tagged versions of Gid5, Gid6, Gid7, Gid8 and Gid9 proteins were generated. Using step glycerol gradient centrifugation it could be shown that Gid5/Vid28, Gid7, Gid8 and Gid9 are also components of a higher molecular mass complex of about 600kDa. Gid1/Vid30, Gid/Ubc8 and Gid4/Vid24 exhibit a sedimentation profile of lower molecular mass slightly overlapping with 600kDa aminopeptidase I. Gid6/Ubp14 is only present in its monomeric form. Use of Gid7 as a bait protein in a co-immunoprecipitation experiment, led to the identification of Gid1/Vid30, Gid2, Gid4/Vid24, Gid5/Vid28, Gid7, Gid8 and Gid9 as interacting components. The protein Gid6/Ubp14 is not part of this protein complex. The direct interaction of Gid4 with Gid5 could be shown via the two hybrid method. Expression profiles on ethanol or glucose of Gid1, Gid2, Gid5, Gid6, Gid7, Gid8 and Gid9 were similar. Gid4/Vid24 was not expressed on ethanol but appears when cells are treated with glucose. As found for Gid3/Ubc8 (Schüle et al., 2000), Gid4/Vid24 seems to disappear during incubation on glucose in a time-dependent fashion. Fructose-1,6-bisphosphatase was found to interact with Gid1 and Gid7 protein. As shown for GID2 (Regelmann et al., 2003) deletion of GID1 and GID7 leads to a block in fructose-1,6-bisphosphatase polyubiquitination. This shows that Gid proteins are directly involved in the ubiquitination process which preceeds proteasome degradation. Two discovered short RING domains in Gid2 and Gid9 (ShRING domains) as well as the discovery of 5 WD40 domains within Gid7 suggest a role of the Gid complex as a novel E3 ubiquitin ligase. The targeted mutation of conserved cysteine residues within the shRING domain of Gid2 could support this theory. Biochemical and molecular methods were used to identify the localization of Gid1, Gid6, Gid7 and Gid8. Interestingly all four Gid proteins were found to be localized in the nucleus. The direct interaction of FBPase with these Gid proteins raised the question of whether FBPase itself had a function in the nucleus of the cell or not. To investigate this question GFP-fusions with FBPase were constructed and localisation studies were performed. An increasing signal of FBPase within the nucleus after onset of catabolite degradation gave proof of the existence of this enzyme in the nucleus as well. Several mutants known to have a defect in nuclear import were tested for the catabolite degradation of FBPase. The protein kinaseA pathway was shown to be the signal transduction pathway triggering FBPase degradation. This led to the discovery of novel putative phosphorylation sites within FBPase by bioinformatics.

Die Glykolyse und die Gluconeogenese sind reziprok gesteuerte, zentrale Stochwechselwege in der Zelle. Die Katabolitdegradation des Enzyms Fructose-1,6-bisphosphatase (FBPase) ist dabei ein zentraler Regulationsmechanismus, um von der anabolen Glukoneogenese zur katabolen Glykolyse zu wechseln. Durch die Zugabe von Glukose zu Zellen, die auf nicht fermentierbaren Kohlenstoffquellen wachsen, erfolgt eine reversible Phosphorylierung der FBPase mit einer daraus resultierenden Verringerung der enzymatischen Aktivität. Anschließend wird das Enzym, mit einer Halbwertszeit von 20-30 min, über das Ubiquitin-Proteasom System proteolytisch abgebaut. In einem genomweiten Screen wurden neun sogenannte gid Mutanten (glucose induced degradation deficient) identifiziert, die einen Defekt in der proteasomalen Katabolitdegradation der FBPase aufweisen. Die Analyse von Gid2 zeigte, daß dieses Protein Teil eines löslichen, zytosolischen Proteinkomplexes mit einer molekularen Masse von wenigstens 600kDa darstellt (Regelmann et al., 2003). Die Thematik dieser Dissertation war es, die neuen Gid Proteine in Hinsicht auf ihre Funktion und ihre mögliche Rolle in einem hochmolekularen Proteinkomplex zu analysieren. Um eine immunologische Detektion der Gid Proteine zu ermöglichen, war es notwendig, chromosomale HA epitopmarkierte Gid5, Gid6, Gid7, Gid8 und Gid9 Proteine zu erzeugen. Mit Hilfe der massenabhängigen Auftrennung dieser Proteine in einem Glyceringradienten war es möglich zu zeigen, dass neben Gid2 auch Gid5, Gid7, Gid8 und Gid9 ausschließlich in den hochmolekularen Fraktionen um 600kDa vorliegen. Gid1, Gid4 und Gid3/Ubc8 sedimentierten hauptsächlich in den niedermolekularen Fraktionen mit einer leichten Überlappung mit den Fraktionen des 600kDa Markerproteins AminopeptidaseI. Gid6/Ubp14 konnte ausschließlich in den niedermolekularen Fraktionen nachgewiesen werden. Durch Co-Immunopräzipitationen konnten mit Hilfe von Gid7 als ‘bait’ Protein Gid1, Gid2, Gid4, Gid5, Gid8 und Gid9 als interagierende Proteine gefunden werden. Das Protein Gid6/Ubp14 war nicht mit Gid7 assoziiert und scheint daher keine Komponente des Gid-Komplexes zu sein. In einem two hybrid Versuch wurde die direkte Interaktion des Proteins Gid4 mit dem Protein Gid5 gezeigt. Die Expressionsprofile auf ethanol- bzw. glucosehaltigem Medium von Gid1, Gid2, Gid5, Gid6, Gid7, Gid8 und Gid9 waren vergleichbar. Gid4 wird unter Derepressionsbedingungen nicht exprimiert und erscheint erst unter Repression nach Glucosegabe. Ähnlich wie Gid3/Ubc8 scheint Gid4 nach seiner Hochregulation wieder abgebaut zu werden. Fruktose-1,6-bisphosphatase konnte durch Coimmunopräzipitationsexperimente als Interaktionspartner von Gid1 und Gid7 nachgewiesen werden. Wie in früheren Arbeiten gezeigt wurde, ist ein Hefestamm, der im GID2 Gen deletiert ist, nicht mehr in der Lage, FBPase zu polyubiquitinieren (Regelmann et al., 2003). Solche Phänotypen konnten auch für GID1 und GID7 Deletionen gezeigt werden. Dies beweist den direkten Einfluß dieser Gid Proteine im Prozeß der proteasomalen Katabolitdegradation von FBPase. Zwei rudimentäre (short) RING Domänen (ShRING) konnten in dieser Arbeit in den Proteinen Gid2 und Gid9 gefunden werden. Die zusätzlich auftretenden fünf WD40 Domänen in Gid7 sind gute Hinweise für die Funktion des Gid Komplexes als neue FBPase spezifische Ubiquitin Ligase. Durch gezielte Mutation der konservierten Cysteinreste der RING Domänen konnte eine solche Theorie im Ansatz bestätigt werden. Durch biochemische und molekularbiologische Versuche konnte gezeigt werden, dass die Proteine Gid1, Gid6, Gid7 und Gid8 zum größten Teil im Zellkern vorzufinden sind. Durch die direkte Interaktion von FBPase mit Gid Proteinen stellte sich nun die Frage, ob FBPase selbst auch im Zellkern nachgewiesen werden kann. Durch die Konstruktion von GFP Fusionen wurde gezeigt, dass FBPase unter Derepressionsbedingungen größtenteils im Cytosol der Zelle vorzufinden ist. Nach Zugabe von Glucose hingegen erscheint ein FBPase spezifisches Signal auch im Zellkern. Eine eventuelle Katabolitdegradation der FBPase im Zellkern wurde daraufhin durch diverse nukleäre Importmutanten getestet. Es konnte auch ein Zusammenhang zwischen der Protein KinaseA abhängigen Phosphorylierung der FBPase und ihrer anschließenden Katabolitdegradation gezeigt werden. Mehrere zusätzliche potentielle Phosphorylierungstellen der FBPase wurden in silico gefunden.