German Title: Zentromerische tRNA und Dnmt2-abhängige Methylierung in Mitotischer Chromosom-Segregation

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Abstract

Centromeres are the primary constriction sites of mitotic chromosomes and a prereq- uisite for chromosome segregation during mitosis. Centromeres serve as a platform for kinetochore formation and spindle attachment and are epigenetically regulated. Specific proteins and protein modifications discriminate centromeric chromatin from the surrounding pericentromeric heterochromatin. Emerging evidence indicates that RNAs are important factors in centromere identity but the composition and regula- tion of centromeric transcripts are largely unknown. Surprisingly, the role of RNA modifications at centromeres is completely unknown. In this doctoral thesis, a subset of transfer RNAs (tRNAs) was found to localise to mitotic centromeres, as well as a number of different RNA processing enzymes. Among them were the cytosine-5 tRNA methyltransferases Dnmt2 and NSun2. Depletion of these enzymes caused severe chromosome segregation defects, suggesting a role of tRNA methylation in mitosis. Strikingly, analysis of enzymatically inactivated Dnmt2 indicated a direct role of cytosine-5 RNA methylation in the regulation of centromeres. Depletion of Dnmt2 affected (peri-) centromeric chromatin compositions, which presumably lead to the observed mitotic defects. The detection of components of the RNA poly- merase III (RNAPIII) transcription machinery suggested a role of active transcrip- tion at centromeres during mitosis. Indeed, inhibition of RNAPIII-mediated tran- scription caused comparable chromosome segregation defects as observed in tRNA methyltransferase mutant backgrounds. Strikingly, the centromeric localisation of RNAPIII appeared sensitive not only to transcriptional inhibition but also to cen- tromeric levels of Dnmt2. Vice versa, Dnmt2 was dependent on centromeric RNA and RNAPIII transcription, which suggests an interdependent role of RNAPIII tran- scription and tRNA methylation at centromeres. This thesis describes a novel role of RNAPIII transcription and tRNA methylation during mitosis in Drosophila, which functionally connects an epitranscriptomic mechanism and the epigenomic regulation of centromeres. Moreover, the mitotic function of Dnmt2 appeared to be conserved in mammalian cells, which suggests a conserved role of RNA modification in the regulation of centromeric chromatin.

Translation of abstract (German)

Centromere sind die primäre Einschnürung auf mitotischen Chromosomen und eine Grundvoraussetzung für Chromosom-Segregation in der Mitose. Centromere dienen als Fundament für die Bildung des Kinetochors und die Verankerung des Spindel- Apparats, und sind epigenetisch reguliert. Spezifische Proteine und Protein-Modifi- kationen unterscheiden centromerisches vom umgebenden pericentromerischen He- terochromatin. Darüber hinaus sammeln sich die Anzeichen dafür, dass RNAs wichti- ge Faktoren für die centromerische Identität sind. Die Komposition und Regulation centromerischer Transkripte ist hingegen weitestgehend unbekannt. Überraschen- derweise ist die Rolle von RNA-Modifikationen am Centromer komplett unbekannt. In dieser Doktorarbeit wurde ein Teil der zellulären Transfer-RNAs (tRNAs) auf mitotischen Centromeren lokalisiert, wo außerdem verschiedene RNA-prozessierende Enzyme detektierbar waren. Unter ihnen waren die Cytosin-5 Methyltransferasen Dnmt2 und NSun2. Die Depletion dieser Enzyme verursachte starke Chromosom- Segregations-Defekte, was eine Rolle der tRNA-Methylierung in der Mitose vermu- ten lässt. Bemerkenswerterweise zeigte die Untersuchung von enzymatisch inaktivier- tem Dnmt2 eine direkte Rolle der Cytosin-5 RNA-Methylierung in der Centromer- Regulation. Die Depletion von Dnmt2 beeinflusste die Komposition von (peri-) cen- tromerischem Chromatin, welches vermutlich zu den beobachteten Defekten führte. Die Detektion von Komponenten der RNA-Polymerase-III (RNAPIII) Transkrip- tionsmaschinerie ließ eine Rolle aktiver Transkription an mitotischen Centromeren vermuten. Tatsächlich führte die Inhibition von RNAPIII-abhängiger Transkripti- on zu vergleichbaren Chromosom-Segregations-Defekten wie durch die Depletion der tRNA-Methyltransferasen. Bemerkenswerterweise war die centromerische Loka- lisation der RNAPIII nicht nur abhängig von aktiver Transkription, sondern auch von centromerischem Dnmt2. Umgekehrt war Dnmt2 abhängig von centromerischer RNA und RNAPIII-Transkription, was einen voneinander abhängigen Zusammen- hang von Transkription und Methylierung am Centromer vermuten lässt. In dieser Arbeit wurde eine bisher unbekannte Rolle der RNAPIII-Transkription und tRNA- Methylierung in der Mitose in Drosophila beschrieben, welches eine funktionelle Verbindung epitranskriptioneller Mechanismen und epigenomischer Regulation des Centromers darstellt. Darüber hinaus erscheint die mitotische Funktion von Dnmt2 als konserviert in Säugetier-Zellen, was wiederum eine Konservierung von RNA- Modifikation in der Regulation von Chromatin bedeuten könnte.