German Title: Untersuchung von Elektrochemilumineszenz (ECL) als hoch sensitiver und effektiver Signaltraeger fuer mikrofluidische Biosensoren

Preview

PDF, English Download (4MB) | Terms of use

Abstract

The conception and realization of microfluidic Total Analysis Systems (microTAS) has revolutionized the analytical process by integrating the whole breadth of analytical techniques into miniaturized systems. Paramount for efficient and competitive microTAS are integrated detection strategies, which lead to low limits of detection while reducing the sample volume. The concept of electrochemiluminescence (ECL) has been especially intriguing ever since the introduction of a version based on Ru(bpy)32+ by Alan Bard in 1972, due to its immense sensitivity, non-existent auto-luminescent background signal, and simplicity in experimental design. Therefore, integrating ECL detection into microTAS is a logical consequence to achieve simple, yet highly sensitive sensors. ECL follows complex electron transfer pathways, and its efficiency can be enhanced, but also hindered, by numerous factors. Our studies identified the novel combination of the coreactant N-butyldiethanolamine (NBEA) with the surfactant Zonyl FSN as an optimal signal enhancer for Ru(bpy)32+-based ECL. This combination of coreactant and surfactant led to a limit of detection (LOD) for Ru(bpy)32+ of 2.2 nM, compared to 0.59 µM for the commonly used Tripropylamine/Triton X-100 system, and a 50-fold increase in sensitivity. Investigations under different buffer conditions revealed that the ECL signal was significantly influenced by buffer composition and pH values. Furthermore it was possible to generate an ECL signal at a potential well below 1.2 V vs. Ag/AgCl, the common potential for Ru(bpy)32+-based ECL. The low oxidation potential (LOP) signal was significantly increased under the use of the coreactant NBEA with Tris buffer at pH 8.5, and was about three times higher than for the standard coreactant, TPA, in phosphate-based buffer at pH 7. Such low potential ECL signals are desirable for electrode lifetime enhancement and prevention of possible DNA damage in bioassays. However, to truly extend a sensor’s limit of detection, one must go beyond a mere one-to-one labeling approach, especially when dealing with DNA, which, by its nature, is mostly present at low concentrations in real-life samples. Liposomes, molecules capable of encapsulating large quantities of analyte and of being DNA-specific, offer a convenient way of enhancing detection capabilities. Therefore, Ru(bpy)32+encapsulating liposomes were successfully synthesized and linked to Cryptosporidium parvum (C. parvum) DNA. ECL detection of the DNA was achieved inside a microfluidic chip with a microfabricated three electrode system. After identification of the appropriate assay and flow parameters, it was possible to achieve on-chip ECL detection in less than ten minutes, while the microfluidic chip was also capable of fluorescent and electrochemical detection. The study not only presents a novel ECL-based microfluidic biosensor, but functioning strategies that are urgently required to increase its usability and sensitivity.

Translation of abstract (German)

Die Konzeptionierung und Realisierung von microfluidic Total Analysis Systems (microTAS) hat durch die Integrierung analytischer Techniken in miniaturisierte Systeme entscheident zur Revolutionierung von analytischen Prozessen beigetragen. Besonders wichtig sind hierbei Detektionsstrategien, die hohe Sensitivitaeten bei geringen Probekonzentrationen erlauben. Elektrochemilumineszenz (ECL) ist hierbei besonders interessant, durch den Wegfall eines Hintergrundsignals, seiner hohen Sensitivitaet und vereinfachtem experimentellem Design. Es ist somit eine logische Konsequenz ECL in microTAS zu integrieren um einfache und gleichzeitig sensitive Sensoren zu erhalten. ECL durchlaeuft komplexe Elektronentransferreaktionen, und seine Effizienz kann durch viele Faktoren positiv, aber auch negativ beeinflusst werden. In der vorgelegten Studie wurden N-butyldiethanolamine (NBEA) mit dem Tensid Zonyl FSN als optimale Signalverstaerker fuer Ru(bpy)32+-basierte ECL identifiziert und fuehrten zu einem Ru(bpy)32+ Detektionslimit von 2.2 nM, im Vergleich zu nur 0.59 µM fuer das meist verwendete System aus Tripropylamine und Triton X-100, und gleichzeitig zu einer 50 mal hoeheren Sensitivitaet. Pufferbedingungen und pH zeigten einen starken Einfluss auf das ECL System mit der Moeglichkeit eines low oxidation potential (LOP) ECL Signals unter der Verwendung des Coreaktanten NBEA mit Tris Puffer bei pH 8.5, welches zu einem drei mal so starken ECL Signal fuehrt als der Standard Coreaktant TPA in phoshpathaltigem Puffer bei pH 7. Die Verwendung von LOP ECL spielt besonders eine Roller bei der Verlaengerung der Verwendungsdauer der Elektroden und der Verhinderung von moeglichen DNA Stoerungen durch zu hohe Spannungen. Um das Detektionslimit noch weiter zu verbessern, ist es essentiell mehrere Signaltraeger mit der Probe zu koppeln, besonders fuer DNA, die generell in natuerlichen Proben in niedrigen Konzentrationen vorliegt. Liposome, die eine grosse Anzahl an Molekuelen einschliessen koennen und sich spezifisch an DNA binden lassen, sind predestiniert fuer diesen Zweck, weshalb Ru(bpy)32+ einschliessende Liposome erfolgreich hergestellt wurden, die an Cryptosporidium parvum (C. parvum) DNA koppeln. Die DNA wurde per ECL in einem mikrofluidischen Chip mit integriertem drei-Elektroden-System detektiert. Nach der Identifizierung der geeigneten experimentellen- und Fliessparametern, war ECL Detektion im Chip in weniger als zehn Minuten moeglich, wobei der Chip auch fuer Fluoreszenz und EC Detektion nutzbar ist. Die vorliegende Studie praesentiert nicht nur einen neuartige ECL-basierten mikrofluidischen Biosensor, sondern auch funktionierende Strategien, um dessen Brauchbarkeit und Sensitivitaet zu erhoehen.