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Abstract

Die vorliegende Dissertation beschreibt die Komplexierung von Cm(III), Eu(III) und Am(III) mit humanem Serumtransferrin. Dieses ist eines der wichtigsten Blutserumproteine,das für den Eisentransport und die Abgabe des Eisens an Zellen verantwortlich ist. Transferrin hat eine komplexe, hochdefinierte dreidimensionale Struktur und ist unterteilt in zwei Lobes, die jeweils eine Bindungsstelle für dreiwertiges Eisen aufweisen. Ziel der Arbeit ist es, die in Lösung vorliegenden An(III)- und Ln(III)-Transferrin-Komplexspezies zu identifizieren und spektroskopisch und thermodynamisch zu charakterisieren sowie die Struktur der entsprechenden Spezies zu analysieren. Von besonderem Interesse sind hierbei Untersuchungen bei physiologisch relevanten Bedingungen (pH 7,4, T = 310 K, c(Carbonat)tot = 25 mM,c(NaCl) = 150 mM). Die Ergebnisse sollen Informationen über den Einfluss von Transferrin auf die Biochemie inkorporierter trivalenter Actiniden in einem Organismus liefern. Neben der zeitaufgelösten Laserfluoreszenzspektroskopie (TRLFS) und der Lumineszenzspektroskopie wurde hierfür die EXAFS-Spektroskopie(Extended X-Ray Absorption Fine Structure) eingesetzt. Mittels TRLFS konnte erstmals die Bildung zweier Cm(III)-Transferrin-Spezies in Abhängigkeit des pH-Werts nachgewiesen werden. Bei der Cm(III)-Transferrin- Spezies I, die im pH-Bereich von 3,5 bis 9,7 gebildet wird, handelt es sich um eine nichtspezifische Komplexspezies, bei der das Metallion an Aminosäurereste auf der Proteinoberfläche bindet. Im Falle der Cm(III)-Transferrin-Spezies II (pH ≥ 7,0) komplexiert Cm(III) an der Fe(III)-Bindungsstelle, wobei die erste Koordinationssphäre durch zwei Wassermoleküle, vier Aminosäurereste des Proteins (His, Asp, 2 x Tyr) sowie drei weitere Liganden (vorzugsweise OH- oder CO32-) gebildet wird. Aufgrund der unterschiedlichen Bindungseigenschaften des C- und N-Lobes erfolgt die Komplexierung von Cm(III) unter den experimentellen Bedingungen dabei ausschließlich an der C-terminalen Bindungsstelle. In Ergänzung zu den Komplexierungsuntersuchungen mit Transferrin wurde die Wechselwirkung von Cm(III) mit dem rekombinanten N-Lobe des humanen Serumtransferrins (hTf/2N), das als Modell für den N-Lobe des Transferrins dient, untersucht. Im Gegensatz zu Transferrin wird mit hTf/2N keine unspezifische Komplexspezies gebildet. Die Cm(III)-hTf/2N-Spezies hingegen steht in exzellenter Übereinstimmung mit der Cm(III)-Transferrin-Spezies II, wodurch die Ähnlichkeit der Koordinationsumgebung an den Bindungsstellen des C- und N-Lobes des Transferrins bestätigt wird. Sowohl die Komplexierung von Cm(III) mit hTf/2N als auch an der C-terminalen Bindungsstelle des Transferrins wird durch eine Temperaturerhöhung von Raumtemperatur (T = 22,0°C) auf physiologische Temperatur (T = 37,5°C) deutlich begünstigt. Die Komplexierungsreaktion ist für beide Proteine endotherm und wird durch einen großen Entropiegewinn getrieben, was auf den ausgeprägten Chelateffekt des Proteins bei einer Komplexierung des Metallions an der Fe(III)-Bindungsstelle zurückgeführt werden kann. Die Cm(III)- Komplexe mit Transferrin und hTf/2N unterscheiden sich jedoch deutlich in ihren Stabilitäten. Dies spiegelt sich auch in den Stabilitätskonstanten der Cm(III)- Transferrin-Spezies II und der Cm(III)-hTf/2N-Spezies wider, die sich um ca. zwei Größenordnungen unterscheiden. Aufgrund der Tatsache, dass Carbonat bei der Komplexierung von Fe(III) mit Transferrin als synergistisches Anion wirkt, sollte untersucht werden, ob Carbonat auch einen Einfluss auf die Komplexierung von Cm(III) mit Transferrin hat. Untersuchungen bei verschiedenen Carbonatkonzentrationen (c(Carbonat)tot = 0 mM, 0,23 mM und 25 mM (physiologische Carbonatkonzentration)) haben dabei gezeigt, dass eine Erhöhung der Carbonatkonzentration die Bildung der Cm(III)-Transferrin- Spezies II bei deutlich kleineren pH-Werten begünstigt. Folglich hat Carbonat auch einen synergistischen Effekt für die Komplexierung von Cm(III) an der C-terminalen Bindungsstelle. Allerdings ist die Carbonatkomplexierung auch eine wichtige Konkurrenzreaktion. Die Bildung der nichtspezifischen Cm(III)-Transferrin-Spezies I wird bei physiologischer Carbonatkonzentration (c(Carbonat)tot = 25 mM) vollständig unterdrückt und auch die Anteile der Cm(III)-Transferrin-Spezies II sind deutlich kleiner als bei Abwesenheit von Carbonat. Im Gegensatz zu Transferrin konnte kein synergistischer Effekt von Carbonat auf die Komplexierung von Cm(III) mit hTf/2N nachgewiesen werden. Stattdessen wird die Bildung der Cm(III)-hTf/2N-Spezies aufgrund der konkurrierenden Carbonatkomplexierung sehr stark zurückgedrängt. In Ergänzung zu den Komplexierungsuntersuchungen von Cm(III) mit Transferrin wurde die Wechselwirkung von Eu(III) mit Transferrin mittels Tieftemperatur-TRLFS untersucht. Während bei pH ≤ 6,0 eine unspezifische Eu(III)-Transferrin-Spezies gebildet wird, die der Cm(III)-Transferrin-Spezies I entspricht, erfolgt bei pH ≥ 7,4 die Komplexierung von Eu(III) analog zur Komplexierung mit Cm(III) an der Fe(III)-Bindungsstelle des Transferrin. Die spektroskopischen Charakteristika zeigen dabei eine identische Zusammensetzung der Koordinationssphären in beiden Komplexen. Neben der Identifizierung und Charakterisierung der verschiedenen Cm(III)- und Eu(III)-Transferrin-Spezies war die Strukturaufklärung ein wichtiges Thema. Zu diesem Zweck wurden EXAFS-Untersuchungen mit Eu(III)- und Am(III)-Transferrin durchgeführt. Die Analyse des Am(III)-Transferrin-Spektrums bei pH 8,5 zeigt das Vorliegen von neun Nachbaratomen im mittleren Abstand von 2,38 Å. Dies entspricht den Abständen, die beim Einbau von Am(III) in Mineralstrukturen auftreten und bestätigt eine starke, multidentate Koordination von Am(III) an der Fe(III)- Bindungsstelle des Transferrinmoleküls. Der Nachweis der unspezifisch gebundenen Transferrinspezies erfolgte anhand von Eu(III)-Transferrin bei pH 7,2, wobei diese Spezies einen wesentlich größeren mittleren Bindungsabstand von 2,41 Å aufweist. Um Aussagen über den potentiellen Transport von Actinidionen im menschlichen Körper treffen zu können, sind die Ergebnisse der Komplexierungsuntersuchungen bei physiologischen Bedingungen (pH 7,4, T = 310 K, c(Carbonat)tot = 25 mM, c(NaCl) = 150 mM) von besonderer Bedeutung. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass unter diesen Bedingungen die Bildung der Cm(III)-hTf/2N-Spezies aufgrund der konkurrierenden Carbonatkomplexierung vollständig unterdrückt wird. Unter der Voraussetzung, dass hTf/2N ein geeignetes Modell für den N-Lobe des Transferrins darstellt, ist die Komplexierung von Cm(III) an der N-terminalen Bindungsstelle somit nicht relevant für den Transport von Actinidionen im Körper. Im Gegensatz hierzu werden unter physiologischen Bedingungen mit Transferrin ca. 15% der Cm(III)-Transferrin-Spezies II gebildet. Dies ist eine wesentliche Voraussetzung für die potentielle Bindung an den Rezeptor sowie die Endocytose in die Zelle. Die vorliegende Arbeit liefert wichtige Informationen über Bindungsmechanismen, Struktur und thermodynamische Daten der Komplexierung trivalenter Actinidionen mit Transferrin. Diese Ergebnisse tragen zu einem besseren Verständnis der relevanten biochemischen Reaktionen trivalenter Actinidionen bei und stellen eine wichtige Grundlage für die Entwicklung potentieller Dekontaminationsstrategien dar.