Alternating amphiphilic polymers : from gels and micelles to translocation through lipid membranes

Kostyurina, Ekaterina; Förster, Stephan Friedrich; Richtering, Walter

doi:HT030365161

Alternating amphiphilic polymers : from gels and micelles to translocation through lipid membranes

Kostyurina, Ekaterina^RWTH*

2023

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Ekaterina Kostyurina, M.Sc.

ImpressumAachen : RWTH Aachen University 2023

Umfang1 Online-Ressource : Illustrationen, Diagramme

Dissertation, RWTH Aachen University, 2023

Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Förster, Stephan Friedrich (Thesis advisor)^RWTH* ; Richtering, Walter (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2023-08-21

Online
DOI: 10.18154/RWTH-2023-08845
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/968858/files/968858.pdf

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
LCST (frei) ; amphiphilic polymers (frei) ; membrane translocation (frei) ; micelles (frei) ; polymeric gels (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 540

Kurzfassung
Amphiphile Polymere besitzen sowohl hydrophobe als auch hydrophile Eigenschaften, wodurch sie in wässrigen Lösungen selbstorganisierende Systeme ausbilden können, oberflächenaktiv sind und gleichzeitig in polaren und unpolaren Lösungsmitteln löslich sind. Daher finden sie auch in der Industrie vielfältige Anwendungen in verschiedenen Bereichen wie Waschmitteln, Landwirtschaft, Lebensmittel, Werkstofftechnik oder Pharmazie. In experimentellen Studien werden in der Regel statistische Copolymer- oder Blockcopolymer-Architekturen untersucht, da sie leicht zu synthetisieren sind oder eine strukturelle Analogie zu Tensiden aufweisen. Eine Copolymerstruktur, die die beiden Architekturen verbindet, ist ein alternierendes Copolymer, das durch Polykondensationsreaktionen leicht zugänglich ist. Die Verwendung alternierender hydrophiler und hydrophober Bausteine mit unterschiedlichen Längen ermöglicht eine systematische Variation zwischen statistischen und Multiblock-Architekturen. In diesem Projekt wurden die alternierenden amphiphilen Polymere (AAP) umfassend und systematisch im Hinblick auf ihre thermodynamischen Eigenschaften, Strukturbildung in Wasser und in einer Anwendung zur Translokation durch Lipidmembranen untersucht. Die meisten der in dieser Arbeit verwendeten AAPs wurden als Polyester aus hydrophoben Dicarbonsäuren und hydrophilen Polyethylenglykoleinheiten (PEG) synthetisiert. Diese Polymere zeichnen sich durch eine untere kritische Lösungstemperatur (LCST) in Wasser aus, wobei die kritische Temperatur durch Anpassung der Längen der hydrophoben und hydrophilen Einheiten im Bereich von 0 bis 100°C variiert werden kann. Darüber hinaus kann die gleiche LCST, die als Maß für die Gesamtpolarität des Polymers verwendet werden kann, durch verschiedene Kombinationen von Längen der hydrophoben und hydrophilen Einheiten erreicht werden. Auf diese Weise kann das Polaritätsprofil entlang der Polymerkette von einem eher homogenen zu einem eher alternierenden Profil verändert werden. Je nach Gesamtpolarität und Polaritätsprofil können die AAPs in Wasser als freie Ketten gelöst werden, Mizellen, Gele oder geordnete kristalline Phasen bilden. Diese Strukturen wurden mittels Röntgenkleinwinkel- und Neutronenstreuung untersucht und ein qualitatives Phasendiagramm erstellt, das die Strukturen in Abhängigkeit von der Länge der hydrophoben und hydrophilen Einheiten darstellt. Die von den AAPs gebildeten Mizellen haben einen ausgeprägten Kern, der aus hydrophoben Domänen besteht, die in eine PEG-reiche und wasserarme Matrix eingebettet sind. Die Mizellenhülle besteht aus einer geringeren Anzahl von PEG-Endgruppen oder internen PEG-Einheiten, die Schleifen bilden. Solche Mizellen unterscheiden sich strukturell von Mizellen, die aus Blockcopolymeren oder Tensiden gebildet werden und bei denen der Kern ausschließlich aus den hydrophoben Einheiten besteht. Die AAP-Gele bestehen aus miteinander verbundenen mizellaren Strukturen, die das Gel mechanisch stabil machen und sich bei hohen Konzentrationen kristalline anordnen können. Durch die Möglichkeit, die Polarität der AAPs einzustellen, können Polymere hergestellt werden, die gleichzeitig in Wasser und in unpolaren Umgebungen, wie z. B. dem Inneren von Lipidmembranen, löslich sind. Wasserlösliche AAPs mit einer solchen ausgewogenen Polarität können passiv Lipidmembranen durchdringen, was in dieser Arbeit eingehend untersucht wurde. Die Translokationseigenschaften wurden systematisch mit zeitaufgelöster Pulsed Field Gradient (PFG) NMR unter Verwendung großer unilamellarer Vesikel (LUV) als Modellmembran untersucht. Das begrenzte Innenvolumen der LUV ermöglicht es die Adsorptions- und Desorptionsraten sowie die Konzentration der Polymers in der Membran zu bestimmen. Dabei stellte sich heraus, dass der Translokationsprozess aus einer relativ schnellen Sättigung der Membran mit den Polymeren und einem langsamen Desorptionsprozess besteht. Die Translokationszeit schwankt zwischen Minuten und Stunden, je nach Polymer- und Lipidzusammensetzung, Polymermolekulargewicht und Temperatur. Auf der Grundlage dieser Messungen wurde ein einfaches thermodynamisches Modell des Translokationsprozesses entwickelt. Untersuchungen mittels Neutronenreflektometrie ergaben, dass sich die AAP mit kurzen hydrophoben/hydrophilen Einheiten hauptsächlich im hydrophoben Inneren der Membran befinden, und zwar in einer Konzentration, die der durch PFG-NMR ermittelten entspricht. Mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie an Giant Unilamellar Vesikels wurde die Möglichkeit des Transports von hydrophoben Molekülen durch die Lipidmembran nachgewiesen. Die Fähigkeit der AAPs, Moleküle durch Lipidmembranen zu transportieren, kann für biomedizinische Anwendungen von Bedeutung sein. Daher wurden die potenziellen zelltoxischen Eigenschaften der AAPs an lebenden HeLa-Zellen getestet. Die als Polyester synthetisierten AAPs zeigten keine sichtbaren Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit dieser Zellen. Daher wurden in einem nächsten Schritt in vivo Translokationsstudien mit fluoreszenzmarkierten AAPs durchgeführt. Die Translokation durch die Plasmamembran von vier verschiedenen Zelltypen wurde in einer Reihe von Fluoreszenzmikroskopie-Messungen nachgewiesen. Die Möglichkeit, die AAP-Zusammensetzung in einem weiten Bereich einzustellen und dabei die Translokationseigenschaften beizubehalten, macht diese Polymere für biomedizinische Anwendungen sehr interessant.

Amphiphilic polymers possess both hydrophobic and hydrophilic properties, which make them able to self-assemble in aqueous solutions, be surface active and have simultaneous solubility in polar and non-polar solvents. Therefore, they find various applications, also in industry, in different areas like detergency, agriculture, food, material engineering or pharmaceutics. In experimental studies, statistical copolymer or block copolymer architectures are usually investigated, because of their ease of synthesis or their structural analogy to surfactants. A copolymer structure that links the two architectures is an alternating copolymer, which is easily accessible by polycondensation reactions. Using alternating hydrophilic and hydrophobic building blocks with varying lengths allows a systematic variation between statistical and multi-block architectures. In this project, the alternating amphiphilic polymers (AAP) were broadly and systematically studied with respect to their thermodynamic characteristics and structure formation in water and in an application to translocation through lipid membranes. Most of the AAPs used in this work were synthesized as polyesters from hydrophobic dicarboxylic acids and hydrophilic polyethylene glycol (PEG) units. These polymers possess a lower critical solution temperature (LCST) behavior in water, where the critical temperature can be varied in the range from 0 to 100oC by adjusting the lengths of hydrophobic and hydrophilic units. Moreover, the same LCST, which can be used as a measure for the overall polymer polarity, can be achieved by different combinations of unit lengths. In this way, the polarity profile along the polymer chain can be changed from a more homogeneous to a more alternating one. Depending on the overall polarity and on the polarity profile the AAPs can be dissolved in water as free chains, form micelles, gels, or ordered crystalline phases. These structures were investigated by small angle x-ray and neutron scattering and a qualitative phase diagram which represents the structures as a function of the hydrophobic and hydrophilic unit lengths was constructed. The micelles formed by the AAP have a pronounced core constructed by the hydrophobic domains embedded in a PEG rich and water poor matrix, whereas the micellar shell consists of a smaller number of PEG end groups or internal PEG units forming loops. Such micelles differ structurally from micelles formed by block copolymers or surfactants, where the core is formed exclusively by the hydrophobic units. The AAP gels are formed by interconnected micellar structures, which make the gel mechanically stable and can arrange in a crystalline order at high concentrations. The ability to tune the AAP polarity allows achieving polymers which are simultaneously soluble in water and non-polar environments as, for example, the interior of lipid membranes. Water soluble AAPs having such a balanced polarity can passively translocate lipid membranes, which was extensively studied in this thesis. The translocation properties were systematically studied by time-resolved Pulsed Field Gradient (PFG) NMR using large unilamellar vesicles (LUV) as model membranes. The restricted LUV inner volume allows to access independently adsorption and desorption rates, as well as the concentration of the translocating species in the membrane. It was found that the translocation process consists of a relatively fast membrane saturation with the polymers and a slow desorption process. The translocation time varies from minutes to hours depending on polymer and lipid composition, polymer molecular weight, and temperature. On the basis of these measurements a basic thermodynamic model of the translocation process was developed. Neutron reflectometry (NR) measurements proved that the AAP having short hydrophobic/hydrophilic units are located mainly in the hydrophobic interior of the membrane. The concentration in the membrane calculated from the NR study was similar to the one obtained by PFG NMR. Using fluorescent microscopy on giant unilamellar vesicles the ability of transferring a hydrophobic molecule through lipid membranes was proved. The ability of the AAPs to translocate and transfer molecules through lipid membranes can be important for biomedical applications. Therefore, potential cell toxicity properties of the AAPs were tested with living HeLa cells. The AAPs synthesized as polyesters showed no visible effect on the viability of these cells. Therefore, as the next step, in vivo translocation studies were performed using a fluorescently labeled AAP. The translocation through the plasma membrane of four different cell types was proved in a series of fluorescence microscopy measurements. The ability to tune the AAP composition in a wide range by still maintaining the translocation properties makes these polymers very interesting for biomedical applications.

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