Electrochemical aptamer biosensors for the detection of amyloid-beta oligomers

Zhang, Yuting; Simon, Ulrich; Offenhäusser, Andreas

doi:10.18154/RWTH-2020-07499

Electrochemical aptamer biosensors for the detection of amyloid-beta oligomers

Zhang, Yuting^RWTH*

2020

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Master of Science in Analytical Chemistry Yuting Zhang

ImpressumAachen 2020

Umfang1 Online-Ressource (XII, 133 Seiten) : Illustrationen, Diagramme

Dissertation, RWTH Aachen University, 2020

Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Simon, Ulrich (Thesis advisor)^RWTH* ; Offenhäusser, Andreas (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2020-07-03

Online
DOI: 10.18154/RWTH-2020-07499
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/794222/files/794222.pdf

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
multielectrode arrays (frei) ; ssDNA aptamer (frei) ; Amyloid-β oligomers (frei) ; Alzheimer's disease (frei) ; stem-loop (frei) ; simultaneous detection (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 540

Kurzfassung
Die Alzheimer-Krankheit (AD) ist die am weitesten verbreitete, chronische, neurodegenerative Erkrankung, die mit einem fortschreitenden und irreversiblen Verlust kognitiver Fähigkeiten verbunden ist. Deren Frühdiagnose ist von besonderer Dringlichkeit, da Alzheimer eine Latenzzeit von mehr als 20 Jahren aufweist. Amyloid-β Oligomere (AβO) sind wichtige diagnostische Biomarker für AD und ein bedeutendes therapeutischen Ziel die Krankheit zu heilen. In letzter Zeit deuten immer mehr Studien darauf hin, dass AβO toxisch für Zellen des zentralen Nervensystems ist, hervorgerufen durch Störung der Funktion von Rezeptoren der Zellmembran sowie Störungen des Ionenaustauschs durch abnormale Membranstrukturen. Daher hat sich die Suche nach Biosensoren, die selektiv und sensitiv AD Biomarker nachweisen können, zu einem bedeutenden Forschungsfeld entwickelt. In dieser Arbeit wird über die Entwicklung von elektrochemischen Aptamersensoren für den spezifischen Nachweis von AβO berichtet, basierend auf der Bindung zwischen diesen Biomarkern und ssDNS Aptamerrezeptoren. Zu Beginn wurde ein einfacher labelfreier elektrochemischer Biosensor hergestellt. Die Analyse der Daten der Elektrochemischen Impedanzspektroskopie (EIS) ergab für diesen Sensor einen breiten linearen Konzentrationsbereich von 0.1 nM bis 500 nM und eine niedrige Detektionsgrenze von 0.03 nM. Weiterhin wurde der Sensor aufgrund seiner hohen Selektivität für die Verfolgung von Aβ Aggregationsprozesse genutzt. Die Ergebnisse wurden durch Rasterkraftuntersuchungen validiert. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass der Sensor für den Nachweis der Biomarker in künstlicher zerebrospinaler Flüssigkeit (aCSF) mit zufriedenstellender Genauigkeit benutzt werden kann. Nach gegenwärtigem Kenntnisstand ist dies der erste labelfreie Aptamersensor für den Nachweis von AβO basierend auf EIS, der mit aCSF duchgeführt werden kann und die Untersuchung des Aggregationsverhaltens von Amyloidmolekülen erlaubt. Um jedoch die unspezifische Bindung zwischen Sensoroberfläche und Analytmoleküle zu unterdrücken und die Sensitivität des AβO Nachweises zu erhöhen, wurde ein Aptasensor basierend auf Stamm-Schleifen Rezeptoren entwickelt. Hierfür wurden die Rezeptoren mit Redoxsonden modifiziert, was einen amperometrischer Nachweis mittels Wechselsstrom-Voltammetrie (ACV) ermöglichte. Der Wechsel des Transducerprinzips war auch für die Miniaturisierung des Sensors von entscheidender Bedeutung, da die hohe Impedanz von Mikroelektroden impedimetrische Nachweise erschwert. Das amperometrische Transducerprinzip beruht auf dem Ladungstransfer von aptamerassoziierten Redoxgruppen, der von Konformationsänderungen des Rezeptors abhängt. Die Stamm-Schleifen Struktur wurde bezüglich der Stammlänge, Spacersequenz und Position der Redoxgruppe am Aptamerrezeptor optimiert. Zusätzlich wurde der Einfluss der Aptamerkonzentration und der ACV Frequenz auf das Sensorsignal untersucht. Von allen getesteten Sequenzen erwies sich (B-3’ Fc) mit der Redoxsonde am 3’- und einer Thiolgruppe am 5’-terminalen Ende als am besten geeignet mit einem breiten Konzentrationsbereich, der sechs Größenordnungen umspannte. Es wurde weiterhin beobachtet, dass die Detektionsgrenze zu niedrigeren Limits verschoben werden kann, jedoch nur auf Kosten eines eingeschränkten Detektionsbereiches. Mikroelektrodenfelder (MEAs) gewinnen stetig an Bedeutung für die Entwicklung von Biosensoren aufgrund hohen Massentransports im Elektrolyten zu den Elektroden, redundanter Messsignale und hoher räumlicher Auflösung. Jedoch ist für diese Systeme die Anzahl an Rezeptoren an der Oberfläche begrenzt und die hohe Impedanz, hervorgerufen durch die geringe Elektrodengröße, erschweren das herunterskalieren der Aptamersensoren. AD ist oft mit Fehlfunktionen der Mitochondrien assoziiert, was sich stark auf die Konzentration an Adenosin Triphosphat (ATP) in Neuronen auswirkt. Die simultane Detektion von AβO und ATP mithilfe desselben MEA Chips stellt eine Chance für die Früherkennung und pathologische Untersuchungen von AD dar. Daher wurde ein Chip entwickelt, der Mikroelektroden enthält deren Oberfläche durch Goldnanostrukturen vergrößert und mit unterschiedlichen Aptamerrezeptoren modifiziert wurde. Linearvorschubvoltammetrie, Rechteckspannungsvoltametrie und Chronoamperometrie (CA) wurden verwendet, um Gold auf die Mikroelektroden zu deponieren (3D-GMEs). Die Oberflächenmorphologie der unterschiedlichen Nanogold-Mikroelektroden wurde mithilfe von Rasterelektronenmikroskopie untersucht und deren elektroaktive Oberfläche durch Oxidations-Reduktionszyklen in schwefelsauren Lösungen ermittelt. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen legten nahe, das Chronoamperometrie den besten Kompromiss zwischen großer elektroaktiver Oberfläche und Sensorstabilität lieferte. CV und EIS wurden verwendet, um die 3D-GMEs elektrochemisch zu charakterisieren. Die Änderungen der Redoxsignal, hervorgerufen durch Konformationsvariationen der Ferrocen-markierten Aptamermoleküle, wurden mit ACV detektiert. Die Stamm-Schleifen-Aptamer modifizierten 3D Goldmikroelektroden waren in der Lage, AβO in einem breiten Konzentrationsbereich von 1 pM bis 200 nM nachzuweisen. Zudem wurde die Selektivität, Stabilität, Wiederverwendbarkeit und Arbeitsfähigkeit in realen Proben untersucht. Abschließend, wurden Methoden zur gezielten elektrochemischen bzw. plasmachemischen Regeneration von ausgewählter Elektroden des Elektrodenfeldes entwickelt, damit weitere Aptamerrezeptoren an diese Elektroden des Sensorfeldes gebunden werden können. Beispielhaft wurden die regenerierten 3D Gold Mikroelektroden mit ATP Aptameren modifiziert und der korrespondierende Analyt in einem Detektionsbereich zwischen 0.01 nM und 1000 nM mit einem Detektionslimit von 0.002 nM nachgewiesen. Abschließend konnten ATP und AβO gleichzeitige in derselben Analytlösung nachgewiesen werden. Die einfache Herstellung, Miniaturisierbarkeit, Sensitivität im Pico-Molarbereich und darunter, als auch Selektivität selbst gegenüber anderen Aβ Spezies macht die hier entwickelten AβO Aptamersensoren interessant für Point-of-Care Anwendungen als auf für pharmakologische Wirkstoffstudien.

Alzheimer’s disease (AD) is the most common chronic neurodegenerative disease characterized by progressive and irreversible cognitive decline. Early detection of AD becomes especially urgent due to its latency more than 20 years and the uncertainty of current diagnosis. Amyloid-β oligomer (AβO) is an important diagnostic marker for Alzheimer's disease (AD) and potential therapeutic target for treating it. Recently, more and more research show that amyloid-β oligomer (AβO) is toxic to brain cells by dysfunction of receptors on the cell surface and ion flow caused by abnormal membrane structures. Therefore, the development of a biosensor that can sensitively and selectively detect AD biomarkers AβO has become an important research field. This thesis reports on the development of electrochemical aptamer sensors (aptasensors) for the specific recognition of AβO based on the binding of these biomarkers to ssDNA aptamer receptors. Firstly, a simple and label-free electrochemical biosensor was realized for the specific recognition of AβO based on the binding of these biomarkers to ssDNA aptamer receptors. From the analysis results of electrochemical impedance spectroscopy (EIS), the novel aptasensor shows a wide linear concentration range from 0.1 nM to 500 nM with a low detection limit of 0.03 nM. Furthermore, owing to the high selectivity among Aβ species, this label-free sensor is used to monitor the process of Aβ protein aggregation, which is validated by atomic force microscope analysis. Besides, the aptasensor can be used to detect AβO in artificial cerebrospinal fluid (CSF) with satisfying accuracy. To our knowledge, it is the first label-free aptasensor for an AβO assay based on EIS that works in artificial CSF and can be used for monitoring Aβ protein aggregation. To overcome the un-specific adsorption of EIS aptasensor and further improve the sensitivity towards AβO detection, an aptasensor based on stem-loop probes was developed for sensitive and specific detection of Aβ oligomers by an amperometric transducer principle using alternating current voltammetry (ACV). Furthermore, the current-signal aptasensor makes it possible to transfer the sensing platform to the next microelectrodes because the too high impedance due to the small electrode size of microelectrode is not benefiting for the improvement of sensor sensitivity. The signal transduction mechanism relies on redox ferrocene (Fc) reporting via charge transfer on a molecular recognition event involving a conformational change of the molecular beacon. The stem-loop structures were optimized by considering the aptamers’ stem length, spacer, and different ferrocene terminals. In addition, the assembly and signal recording including aptamer concentration and ACV frequency are discussed. Using the optimized stem-loop probe (B-3’ Fc), the aptasensor showed an increase of the Fc peak current induced by AβO binding within the broad concentration range spanning six orders of magnitude. Furthermore, the detection limit of the sensor can be further decreased by optimizing the ACV frequency, however at the costs of a narrowed detection range. Multielectrode arrays (MEAs) have been increasingly used for biosensors due to their fast mass transfer rate, redundant signal recording and high spatial resolution. However, the number of receptors on the transducer surface is limited, and the high device impedance caused by the small size of the microelectrode hampers the downscaling of emerging biosensors concepts such as aptasensors. AD is often associated with mitochondrial dysfunction, which is closely related to the level of adenosine triphosphate (ATP). Therefore, simultaneous detection of AβO and ATP on the same MEAs chip has significance for the early detection of AD and pathological study of other neurodegenerative diseases. Therefore, a multi-aptamer modified MEA chip was developed based on microelectrodes with electrodeposited 3D nanostructured gold (3D-GMEs). Linear sweep voltammetry, square wave voltammetry and chronoamperometry (CA) were used to electrodeposit gold on the microelectrode surface. The surface morphologies of the 3D-GMEs obtained by different deposition conditions were observed by scanning electron microscopy, and the electroactive areas of the 3D-GMEs were obtained by cyclic voltammetry (CV) in 0.05 M H2SO4. Considering the results of the topographical characterization and obtained electrochemical active area, CA was used for electrodeposition to achieve the optimal stability and large active areas. CV and electrochemical impedance spectroscopy were utilized for the electrochemical characterization of gold electrodeposited electrodes, and alternating current voltammetry was used to detect signal changes of labeled ferrocene after aptamer conformation change due to target-aptamer binding. The stem-loop aptamer modified 3D gold microelectrode was used to detect AβO with a wide linear range from 1 pM to 200 nM. The selectivity, stability, reusability, and real sample detection of the aptasensor are also investigated. Finally, to realize the modification of different aptamer receptors at different 3D-GMEs on the same MEAs chip, electrochemical cleaning and plasma cleaning were also applied for 3D-GMEs regeneration. The regenerated 3D gold microelectrodes can be used for the new modification of aptamer again ATP, and the developed aptasensor shows a linear range from 0.01 nM to 1000 nM for ATP detection. Finally, ATP and AβO could be detected simultaneously in the same analyte solution. The easy fabrication, miniaturization, pico-molar and lower sensitivity, as well as selectivity even over other Aβ species make the developed electrochemical aptasensors interesting for point-of-care applications rather than for pharmacological drug studies.

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