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Multiplexed intracellular single-cell sensing strategies of microorganisms integrated for cultivation in microfluidic devices = Intrazelluläre Multiplex-Messmethoden für Einzelzellen von mikrofluidisch kultivierten Mikroorganismen
2020
Dissertation, Rheinisch-Westfälische Technische Hochschule Aachen, 2020
Zweitveröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University
Genehmigende Fakultät
Fak04
Hauptberichter/Gutachter
;
Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2020-03-13
Online
DOI: 10.18154/RWTH-2020-03855
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/787031/files/787031.pdf
Einrichtungen
Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
fluorescence (frei) ; intracellular sensing (frei) ; microfluidic devices (frei) ; microfluidics (frei) ; multiplexing (frei)
Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 620
Kurzfassung
Intrazelluläre Messung in Mikroorganismen ist herausgefordernd durch deren schnelle Reaktion auf Umweltveränderungen und den Möglichkeiten von unbeeinträchtigenden Intrazellulärsonden für verlässliche Lebendeinzelzellanalyse. Die vorgelegte Doktorarbeit zeigt die Umsetzung von Multiplexfluoreszenzkonzepten zur Echtzeitbildgebung mit konventioneller Expression von Fluoreszenzfusionsproteinen und neuartiger, non-toxischer Fluoreszenz in situ Färbung (FISS) in kontrollierter mikrofluidischen Umgebung. Stressende Wachstumsbedingungen mit nachfolgenden Erholungsphasen wurden in mikrofluidischen Kultivierungssystemen simuliert um Verhalten von Zellen und deren Tochterzellen durch Zeit- und Einzelzell-aufgelöste Mikroskopie zu beobachten. Zunächst wurde die sporadische Promotoraktivität des SOS-Kaskadengens recA und die Induktion des Prophagen CGP3 unter stressfreien Bedingungen und unter Nährstoffarmut bestimmt. Die beteiligten Promotorinduktionen wurden durch spontan induzierte Induktion von Fusionsproteinfluoreszenzen in einem Baterium analysiert. Phänotypische Minderheitbildung und individuelle Zellschicksale wurden durch eyfp, e2-crimson und venus visualsiert. Desweiteren wurden neuartige non-invasive, unmittelbare Messmethoden ohne Anspruch auf genetische Modification entwickelt um heterogene Zellzustände wachsender Wildtypbakterien durch fluorogene Moleküle zu unterscheiden. Eine innovative Herangehensweise ergänzend zu konventionellen Kultur-basierten Methoden ist die Verwendung fluorogener Substrate mit Enzym-labilen funktionellen Gruppen für die Einzelzellanalyse. Folglich wurde Acetoxymethylester (AM) als Vektormolekülrest von aromatischen Verbindungen für C. glutamicum entdeckt. Dies wurde gezeigt durch Multiplexfluoreszenzbildgebung mit sechs fluorogenen AM-gekoppelten Sondenmolekülen zur Messung intrazellulärer Parameter (Metabolische Aktivität, Dormanz, Alterung, Zelllyse, apparenter Antibiotiktoleranz, Chemotoxizität, Phototoxizität, spontaner intrazellulärer Radikalbildung und intrazellulärem pH). Zudem wurde die Schutzfunktion der Zellwand oder der Zellmembran nativer Wildtypen durch neue Lebendzellmessung auf der Basis von dynamischer FISS mit Propidiumiodid und PO-PRO-1 untersucht. Der Funktionsverlust der Zellaußenbarrieren, programmierter Zelltod, Überlebendzellen mit entwickelnder non-Gen-basierter Antibiotikatoleranz und Resistenz gegenüber Gen-basierter Produktion eines lytischen Toxins wurden phänotypisch definiert durch diffusives Eindringen von Sondenmolekülen bei spezifischer Phänotypenentwicklung.Intracellular sensing in microorganisms is challenging due to their fast response to environmental changes and the possibilities of unbiased intracellular probes for reliable live single-cell analysis. The submitted PhD thesis presents implementation of multiplexed fluorescence real time imaging concepts using conventional fluorescent fusion protein expression and novel non-toxic fluorescence in situ stainings (FISS) in a controlled microfluidic environment. Stressful growth conditions with subsequent recovery phases were simulated in microfluidic cultivation devices to study behaviour of cells and their descendants by time and single-cell resolved microscopy. Firstly, the sporadic promotor activities of the SOS cascade gene recA and of the induction of prophage CGP3 were determined under non-stressful conditions and under nutrient depletion. The involved promotor inductions have been analysed by spontaneous induced fusion protein fluorescences in a bacterium. Phenotypic minority formation and individual cell fates were visualized using eyfp, e2-crimson, and venus. Second, novel non-invasive, instantaneous sensing methods were developed without the requirement of genetic modification, to distinguish heterogeneous cell states of growing wild type bacteria using fluorogenic molecules. An innovative complementary approach to conventional cultivation-based methods is utilization of fluorogenic substrates with designed enzyme-labile moieties for live cell analysis. Hence, acetoxymethyl ester (AM) has been discovered as shuttle molecule moiety of aromatic compounds for C. glutamicum. This has been demonstrated for multiplexed imaging with six fluorogenic probe molecules coupled to AM to sense intracellular parameters (metabolic activity, dormancy, aging, cell lysis, apparent antibiotic tolerance, chemotoxicity, phototoxicity, spontaneous intracellular radical formation, and intracellular pH). Further, the protective function of the cell wall or cell membranes of native wild types have been analysed by novel live-cell sensing based on dynamic FISS with propidium iodide and PO-PRO-1. Loss of function of the cellular barriers, programmed cell death, survivor cells with evolving non-gene based antibiotic tolerance and resistance to gene based lytic toxin production were defined phenotypically by diffusive intrusion of probe molecules due to their specific phenotype development.
OpenAccess: 
PDF
Dokumenttyp
Dissertation / PhD Thesis
Format
print, online
Sprache
English
Externe Identnummern
HBZ: HT020387613
Interne Identnummern
RWTH-2020-03855
Datensatz-ID: 787031
Beteiligte Länder
Germany
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