Bioavailability and impact of sediment-bound endocrine disrupting chemicals on fish in context of flood events

Müller, Anne-Katrin; Schäffer, Andreas; Hollert, Henner; Segner, Helmut

doi:10.18154/RWTH-2020-04225

Bioavailability and impact of sediment-bound endocrine disrupting chemicals on fish in context of flood events = Bioverfügbarkeit und Auswirkungen von sedimentgebundenen endokrin wirksamen Chemikalien auf Fische im Kontext von Hochwasserbedingungen

Müller, Anne-Katrin^RWTH*

2020

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Master of Science Anne-Katrin Müller

ImpressumAachen 2020

Umfang1 Online-Ressource (XIV, 178 Seiten) : Illustrationen, Diagrame

Dissertation, RWTH Aachen University, 2020

Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Hollert, Henner (Thesis advisor) ; Schäffer, Andreas (Thesis advisor)^RWTH* ; Segner, Helmut (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2020-02-27

Online
DOI: 10.18154/RWTH-2020-04225
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/787719/files/787719.pdf

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
endocrine disruptors (frei) ; estrogen activity (frei) ; flood events (frei) ; remobilization (frei) ; sediment (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
In den vergangenen Jahren haben eine Vielzahl von Studien gezeigt, dass sich diverse Umweltschadstoffe im Flusssediment anreichern. Darunter befinden sich auch solche Schadstoffe, die das endokrine System stören - sogenannte endokrine Disruptoren (EDs). Europaweit wurde eine Östrogene Aktivität in Flusssedimenten mittels in vitro Biotests von 0.02 bis zu 55 ng 17β-Estradiol (E2) Äquivalenten (EEQs)/g Sediment nachgewiesen. Dies ist von besonderer Bedeutung, da bereits bekannt ist, dass EDs schon in geringster Konzentration im Wasser von einigen Nanogramm pro Liter zur Verminderung der Reproduktionsleistung von Fischen führen können. Vor allem die Feminisierung männlicher Fische wurde als ein adverser Effekt der EDs Exposition mit hoher Umweltrelevanz beobachtet. Kennzeichen für die Feminisierung der männlichen Fische sind die Produktion des weiblichen Eidotterproteins Vitellogenin und die simultane Entwicklung sowohl männlicher als auch weiblicher Geschlechtsmerkmale innerhalb eins Individuums, bekannt als Intersex. Dies hat eine verminderte Reproduktionsleistung zur Folge, was bis hin zum Aussterben von einer ganzen Fischpopulation führte. Hingegen ist bislang wenig erforscht, ob die im Sediment abgelagerten EDs bioverfügbar für Fische sind und das endokrine System negativ beeinträchtigen. Die im Sediment zwischengelagerten Schadstoffe könnten durch Resuspension (und Desorption), hervorgerufen durch z.B. menschliches Einwirken wie Ausbaggern, aber auch natürliche Ereignisse wie ein Hochwasser, demobilisiert werden und so in hohen und potenziell toxischen Konzentrationen für Fische in der Wasserphase verfügbar werden. In den letzten Jahren wurden einige extreme Hochwasser in Mitteleuropa inklusive Deutschland beobachtet. Das Auftreten solcher extremen Ereignisse wird zukünftig im Kontext der globalen Klimaerwärmung mit großer Wahrscheinlichkeit zunehmen. Daher wurde vom Europäischen Parlament die Direktive 2007/60/EC zur Risikobewertung von Hochwasserereignissen erlassen. Bestandteil einer solchen Bewertung ist unteranderem die Evaluierung potenzieller Schadstoffquellen als Folge des Hochwassers. Die Hauptzielsetzung dieser Arbeit, als Teil des interdisziplinären Projekthaus Wasser - gefördert durch die Deutsche Exzellenz Initiative - , war es daher: (i) die Bioverfügbarkeit der sedimentgebundenen endokrin wirksamen Schadstoffe in Hinblick auf ihre Remobilisation während eines Hochwasserereignisses abzuschätzen; (ii) die damit verbundene Gefahr einer Störung des endokrinen Systems in Fischen während eines solchen Hochwasserereignisses zu evaluieren und (iii) die Auswirkungen der sedimentgebunden EDs auf heimische Fischarten in einem Fluss mit hoher sedimentbürtiger Belastung abzuschätzen. Diese Studie liefert gemäß der Forderung der europäischen Kommission Aufschluss über ein bestehendes Umweltproblem, trägt dazu bei, dieses Risiko einzuschätzen und ermöglicht somit eine regulatorische Handlungsfähigkeit. Um die Bioverfügbarkeit von sedimentgebundenen EDs abzuschätzen, wurde ein Fluss in der Nähe von Leipzig, der zuvor als „Hot-Spot“ für endokrine Wirksamkeit im Sediment identifiziert wurde, die Luppe, als Untersuchungsort gewählt. Die endokrine Aktivität des Sediments in der Luppe sowie die Konzentration einiger EDs wurde mittels chemischer Analytik (LC-MS/MS) untersucht, zusätzlich zu einem neuartigen in vitro Biotest, der in Anschluss an eine chromatische Auftrennung direkt auf der Dünnschichtplatte durchgeführt wird (plate Yeast Estrogen Screen (p-YES)). So konnte gezeigt werden, dass der Großteil der endokrinen Aktivität aus dem Sediment von 20 ± 2.4 ngEEQ/g auf die hohen Konzentrationen von Estron (E1: 50%) und Nonylphenol (NP:35%) zurückzuführen ist. Des Weiteren trug E2 mit ca. 14% maßgeblich zu der endokrinen Aktivität bei, während die Konzentrationen und Wirksamkeit von 17α-Ethinylestradiol (EE2) mit 1% vernachlässigbar waren. Zwei passive Probenahmesysteme (polar organic chemical integrative sampler (POCIS) und Chemcatcher) wurden verwendet, um die Bioverfügbarkeit dieser Stoffe aus dem Sediment der Luppe unter Suspensionsbedingung ähnlich dem eines Hochwassers zu untersuchen. Anhand der passiven Probenahmesysteme konnte gezeigt werde, dass NP, E1, E2, aber auch EE2, unter Suspensionsbedingungen in umweltrelevanten Konzentrationen aus dem Sediment in die Wasserphase frei wurden (NP 18 µg/L, E1 14 ng/L, E2 0.2 ng/L, EE2 0.5 ng/L). Beide Probenahmesysteme erwiesen sich dabei als geeignet für die Anwendung in einem Sediment-Wasser-Suspensionssystem. Darüber hinaus wurde in einer Laborexpositionsstudie mit juvenilen Regenbogenforellen (Oncorhynchus mykiss) die Umweltrelevanz dieser remobilisierten endokrinen Schadstoffe aus dem Sediment abgeschätzt. Hierbei wurde untersucht, ob die Aufnahme der remobilisierten endokrinen Schadstoffe aus dem Sediment der Luppe während eines simulierten Hochwassers zu Veränderungen des endokrinen Systems dieser Fische führte. Dazu wurden die Forellen über 21 Tage gegenüber Sediment unter konstanter Suspension in nachfolgenden Behandlungen exponiert: (i) einem belasteten Sediment aus der Luppe, (ii) einem geringfügig belasteten Kontrollsediment, (iii) einer seriellen Verdünnung aus belastetem Luppe- und Kontrollsediment (1:8; 1:4; 1:2) und (iv) einer Wasserkontrolle. Die mittels in vitro Biotest nachgewiesene Estrogene Aktivität und die detektierten Konzentrationen von E1 und NP mittels LC-MS/MS in den Sedimenten, dem Wasser sowie in Blut- und Gallenproben der exponierten Fische aus den unterschiedlichen Behandlungen bestätigte die Bioverfügbarkeit der sedimentgebundenen EDs unter Hochwasserbedingungen. Interessanterweise wiesen die gemessenen Konzentrationen von NP und E1 im Wasser und Fisch, Blut sowie Galle, übereinstimmende Muster auf, was den Schluss nahelegt, dass die Aufnahme der aus dem Sediment remobilisierten Stoffe über die Wasserphase stattfand. Die Induktion von estrogenabhängigen Gene in der Leber der männlichen Fische, die gegenüber dem Sediment aus der Luppe exponiert wurden, zusammen mit erhöhtem Vitellogenin Gehalt gemessen in der Schleimhaut dieser Fische deuten auf eine endokrine Antwort in den männlichen Fischen hin. Darüber hinaus war die Abundanz von Transkripten kodierend für eine Vielzahl von Genen in der Leber, die an der Zellzykluskontrolle beteiligt sind, in den Luppe exponierten Fischen signifikant vermindert. Selbiger Effekt wurde auch in Fischen der Sedimentkontrolle beobachtet. Diese Veränderungen auf Genebene stimmt mit den histologischen Veränderungen in der Leber auf Organebene überein. In den Lebern aller exponierter Fische, ausschließlich der Wasserkontrolle, wurden lokal begrenzte Zelllysen, Veränderungen des Nukleus sowie Infiltration von Immunzellen beobachtet. Dies lässt den Rückschluss zu, dass die Exposition gegenüber den gelösten Sedimentpartikeln einen zellulären Stress ausgelöst hat. In einer Feldstudie wurde zudem untersucht, ob die an der Luppe heimischen Fische durch den Kontakt zu dem hoch belasteten Sediment endokrine Veränderungen wie Intersex aufweisen. Hierzu wurden Schleien und Rotaugen an der Luppe gefangen sowie an einem Referenzfluss, der Laucha, zusätzlich zu Fischen aus einer kommerziellen Aquakultur, die als Referenz gelten. Benthisch lebende Würmer (Lumbriculus variegatus) wurden dem Luppesediment gegenüber exponiert, um zu evaluieren, ob sedimentgebundene EDs über die Nahrung an die Fische weitergereicht werden können. Die vergleichsweise 153-fach höhere Estrogene Aktivität gemessen mittels in vitro Biotests in den Sedimentproben der Luppe bestätigte die Laucha als Referenzfluss. Des Weiteren wurde eine Estrogene Aktivität von 14 ng EEQ/mg in den Wurmextrakten gemessen, was bestätigt, dass die Nahrung einen Expositionspfad für Fische darstellen kann. Während sich die gemessenen Konzentrationen an NP im Blut der Fische von der Luppe nicht von denen der Laucha unterschieden, wurde eine Induktion des Biomarkers Vitellogenin in den an der Luppe gefangenen männlichen Fischen im Vergleich zur Laucha und den Referenzfischen aus der Aquakultur beobachtet. Untersuchungen der männlichen Gonade erbrachten jedoch keinen Hinweis auf den Einfluss von endokrin wirksamen Schadstoffen. Die Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass sedimentgebundene Schadstoffe an der Luppe zu der Gesamtbelastung an EDs in den Fischen beitragen, diese scheint jedoch nicht zu einer Beeinträchtigung der Gonaden Entwicklung zu führen und somit voraussichtlich den Fortbestand der Populationen nicht negativ zu beeinflussen. Diese Arbeit konnte herausstellen, dass Sedimente sowohl eine Senke als auch Quelle für EDs darstellen können. Die sedimentgebundenen EDs wurden während der Suspension des Sedimentes, ähnlich wie in einem Hochwasserereignis, bioverfügbar für die exponierten Fische, wobei eine Aufnahme über die rückgelösten EDs im Wasser den Hauptexpositionsweg darstellen könnte. Die passiven Probenahmetechniken (passive sampling) stellten sich als äußerst hilfreiche Instrumente heraus, um die Bioverfügbarkeit von sedimentgebundenen EDs unter Suspensionsbedingungen zu bewerten. Diese könnte auch in einem regulatorischen Kontext zur Anwendung gebracht werden. Zusammenfassend werden die in dieser Arbeit gewonnenen Ergebnisse zu einer verbesserten Risikobewertung von sedimentgebundenen endokrinen Schadstoffen beitragen.

To date, numerous studies worldwide have demonstrated that sediments function as a sink for a great variety of environmental pollutants, among them are substances interfering with the endocrine system, so called endocrine disrupting chemicals (EDCs). Estrogenic activity evaluated in sediment samples across Europe via in vitro bioassays ranged from 0.02 up to 55 ng 17β-estradiol (E2) equivalents/g sediment. This is of particular concern since it is well documented that waterborne exposure to even low ng/L concentrations of EDCs can impair the reproduction of freshwater fish species. Feminization of male fish is one of the most notable adverse impacts of exposure to EDCs and the production of the female egg yolk protein vitellogenin (vtg) has been observed to coincide with impairment of gonadal development evident as intersex and, ultimately, reproductive failure. In contrast, little is known about the bioavailability and effects of sediment-associated EDCs on fish. Particularly when sediments are perturbed, e.g., during flood events, sediment-bound substances may become bioavailable. During the past decades, several extreme flood events have occurred in central Europe, including Germany. The likelihood and intensity of flood events have been predicted to increase as a result of global climate change. As consequence, the European Parliament established the Directive 2007/60/EC on the assessment and management of flood risk. In order to minimize adverse consequences of flood events to humans and the environment part of such risk assessment is the evaluation of potential sources of environmental pollution as result of flooding. The main objectives of the present thesis, as part of the interdisciplinary Project House Water - a project supported by the German Excellence initiative - , were to (i) investigate the bioavailability of sediment-bound EDCs under flood-like conditions when the sediment is subject to suspension; (ii) evaluate the uptake of sediment-bound EDCs during such a simulated flood event into fish and whether this leads to endocrine responses in the fish and (iii) assess the impact of sediment-bound EDCs to freshwater fish species inhabiting a “hot-spot” of EDC contamination in sediment under field conditions. In doing so, this thesis aimed to provide implications for risk evaluation of sediment associated contaminants with special emphasis on flood events. In order to assess the bioavailability of sediment-bound EDCs, the Luppe River previously described as a “hotspot” for EDC accumulation in sediment was chosen as a study site. The concentration of target EDCs and estrogenic activity of sediments from the Luppe River were investigated using chemical analysis (LC-MS/MS) in addition to effect-based methods, such as a novel screening tool (planar Yeast Estrogen Screen; p-YES) that utilizes high performance thin-layer chromatography plates in combination with an in vitro bioassay (YES). Estrone (50%, E1) and nonylphenol (35%, NP) accounted for the majority of estrogenic activity reported for sediment with up to 20 ± 2.4 ng 17β-estradiol equivalents (EEQ)/g dry weight in the Luppe sediments. E2 accounted for approximately 14% of the estrogenic effect, whereas the estrogenic effect attributed to 17α-ethynylestradiol (EE2), when present, was negligible (approx. 1%) from sediment across all Luppe sampling sites. Two types of passive samplers (polar organic chemical integrative sampler (POCIS) and Chemcatcher) were used to investigate the bioavailability of EDCs from suspended sediment under laboratory conditions. NP, E1, E2 and EE2 were remobilized from Luppe sediment when subjected to turbulent conditions, such as in a flood event, and were readily bioavailable at ecotoxicologically relevant concentrations (NP 18 µg/L, E1 14 ng/L, E2 0.2 ng/L, EE2 0.5 ng/L). Both types of passive samplers were applicable in a sediment-water suspension system, with the Chemcatcher displaying higher sampling rates compared to the POCIS. A laboratory exposure study with juvenile rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) was conducted to evaluate uptake and ecotoxicological impact of remobilized sediment-bound EDCs from the Luppe River. Therefore, rainbow trout were exposed over 21 days to constantly suspended sediment in the following treatments: i) a contaminated sediment from the Luppe River ii) a control sediment (exhibiting only background contamination), iii) a serial dilution of Luppe sediment with the sediment control (1:8; 1:4; 1:2), and iv) a water-only control. Measured estrogenic activity using in vitro bioassays as well as target analysis of NP and E1 via LC-MS/MS in sediment, water, fish plasma, as well as bile samples, demonstrated that sediment-bound EDCs became bioavailable during the simulated flood event. EDCs were dissolved in the water phase, as indicated by passive samplers, and were readily taken up by the exposed trout. Interestingly, similar patterns of EDCs were observed in the water and fish blood and bile, suggesting that EDCs partitioned from sediment into the water and subsequently absorbed by the fish, indicating that freely dissolved aqueous concentrations of EDCs might be a major route for uptake of EDCs in fish. An estrogenic response of fish to Luppe sediment was indicated by increased abundance of transcripts of typical estrogen responsive genes, i.e. vitelline envelope protein α, in the liver and vitellogenin induction in the skin mucus. Hepatic gene expression profiles by RNA-sequencing were altered in Luppe exposed fish compared to controls, whereas the repression of a great number of genes involved in cell cycle in combination with induction of apoptotic markers suggest a broader response. However, similar downregulation of cell cycle genes was observed with the sediment control. Together with histological alterations, i.e. local areas of cell lysis, infiltration of immune cells and degenerative nuclear alterations, observed in the liver of fish throughout all treatments, indicates that exposure to suspended particles might elicit stress at the cellular level. Moreover, tench (Tinca tinca) and roach (Rutilus rutilus) as a benthic and pelagic living fish species, respectively, were sampled at the Luppe River. A field reference site, the Laucha River, in addition to fish from a commercial fish farm as a reference were studied. Blackworms (Lumbriculus variegatus), which are a source of prey for fish, were exposed to sediment of the Luppe River and estrogenic activity of worm tissue was investigated using in vitro bioassays. A 153-fold greater estrogenic activity was measured using in vitro bioassays in sediment of the Luppe River compared the Laucha River. Estrogenic activity of Luppe exposed worm tissue (14 ng EEQ/mg) indicated that food might act as secondary source to EDCs. While there were no differences in concentrations of NP in plasma of tench from the Luppe and Laucha, vtg as biomarker for exposure to EDCs was induced in male tench and roach from the Luppe River compared to both the Laucha and commercially cultured fish by a factor of 264 and 90, respectively. However, no histological alterations in testis of these Luppe exposed fish were observed. Our findings suggest that sediments substantially contribute to the overall EDC exposure of both benthic and pelagic fish in the field but that the exposure did not translated to adverse effects on the gonad level and, thus, might not be of relevance for the reproductive success of these populations in the wild. The present thesis demonstrated that sediments not only function as a sink for EDCs but can turn into a significant source of pollution when sediments are resuspended. The results demonstrated that sediment-bound EDCs were readily bioavailable for fish under conditions similar to those of a flood event. Partitioning of EDCs into the water phase might be a major route for uptake of remobilized sediment-bound EDCs into the fish. Passive sampling was a useful tool to assess the bioavailability of sediment-bound EDCs and could be a good indicator of sediment toxicity in a regulatory context. Overall, the work described in this thesis greatly contribute to the assessment of sediment-bound EDCs in the context of flood risk.

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